移植肾间质纤维化与抗纤维化研究进展

王昊天 王毅

肾移植已成为改善终末期肾病患者身体状况和生活质量的最佳选择。近年来,移植肾的短期存活率已有了明显提高,但长期存活率仍不理想。移植肾间质纤维化是由于在各种损伤因素的刺激下,细胞外基质(extracellular matrix,ECM)产生和降解失衡所引起的进行性肾功能减退,最终造成移植肾失功[1]。在Banff分类中,将慢性移植物病变定义为肾间质纤维化(renal interstitial fibrosis)、肾小管萎缩(renal tubular atrophy)、动脉纤维内膜增厚、小动脉透明变性、系膜基质增加和移植肾小球病[2,3]。由于肾小管间质占肾脏体积的90%,而肾间质纤维化和肾小管萎缩往往又同时发生,故肾间质纤维化/肾小管萎缩是CAD最突出的病理表现,常作为一个因素进行评估。在移植术后3～6个月时,约40%的同种异体移植肾可检测到肾间质纤维化/肾小管萎缩,术后2年增加至约65%[4]。但是,到目前为止,笔者发现还没有证据表明移植肾间质纤维化的病理与一般肾疾病中观察到的间质纤维化病理存在显著差异,因此,本文讨论一般肾疾病间质纤维化及抗纤维化过程,着重关注在移植肾领域的进展,综述如下。

1 肾间质纤维化发生的主要机制

肾小球和肾小管损伤后的早期纤维化是有效恢复的表现,但在疾病的中晚期,组织损伤严重或反复损伤超过周围实质细胞的再生能力,间质纤维结缔组织大量增生,正常组织修复失衡,此时纤维化则为病理性的[5-8]。移植肾间质纤维化可由免疫和非免疫损伤引起。Mortensen等[9]研究分析确定了4种与间质纤维化程度高度相关的蛋白,结果与细胞骨架构建和免疫反应是移植肾间质纤维化普遍过程的观点相符。

1.1 参与肾间质纤维化过程的细胞 不同细胞类型参与了间质纤维化过程,有参与排斥反应的免疫细胞,有介导ECM沉积的肾小球系膜细胞、成纤维细胞、周细胞以及血管平滑肌细胞,介导血栓性微血管病变的内皮细胞,还有参与免疫反应的B细胞,T细胞等,这些细胞直接或间接受到影响,发生一系列反应并介导损伤与修复。在纤维化的后期,几乎所有的细胞参与其中[10]。

肌成纤维细胞表达α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA),可以增加胶原纤维和ECM大分子的表达,并抑制ECM降解酶,是介导IF/TA发生的主要效应细胞之一[11]。其有多种细胞来源,如成纤维细胞、血管周细胞、肾小管上皮细胞等。Kuppe等[10]利用单细胞RNA测序分析了健康和纤维化肾脏中近端小管和非近端小管细胞的转录体,确定了周细胞和成纤维细胞的不同亚群是肾间质纤维化过程中肌成纤维细胞的细胞来源。上皮间质转化(epithelial mesenchymaltr ansition,EMT),内皮向间质转化(endothlial mesenchymal transition,EndoMT)均是肌成纤维细胞来源和诱导移植肾间质纤维化的机制[12-14]。转化生长因子-β(TGF-β)超蛋白家族、炎性因子以及活性氧等几种自分泌或旁分泌信号分子可诱导EndoMT发生,而血管内皮生长因子-A和一些microRNA(如miR-155)则是EndoMT的负调控因子[15,16]。

巨噬细胞是肾间质纤维化发生过程中的关键细胞类型。Li等[17]研究表明巨噬细胞可通过p38信号通路激活使同种异体移植炎症因子1的表达上调,促进肾成纤维细胞活化为促纤维化表型。有两种不同的巨噬细胞类型介导肾损伤和修复:促炎型(M1)和抗炎型(M2)。Wang等[18]研究发现,在小鼠肾移植模型中,约一半的α-SMA+肌成纤维细胞来自于受者骨髓源巨噬细胞,并且骨髓源M2型巨噬细胞可通过Smad3依赖性机制促进巨噬细胞向肌成纤维细胞转变(macrophage to myofibroblast transition,MMT),有助于移植肾间质纤维化形成。

γδ T细胞是一种效应性淋巴细胞,在间质纤维化过程中发挥重要作用。Law等[19]在有间质纤维化的人肾活检组织中检测到γδ T细胞数量显著升高,聚集于肾小管间质;并首次发现γδ T细胞是促炎细胞因子IL-17A的来源。

1.2 参与肾间质纤维化发生的反应

1.2.1 炎症和排斥反应:2017年和2019年Banff标准中依据慢性移植肾间质纤维化和肾小管萎缩区域内炎症细胞浸润程度,对慢性活动性T细胞介导的排斥反应新增了严重程度的分级,表现出对隐匿、持续的排斥反应所致的IF/TA的重视,体现出间质纤维化区域内炎症(inflammation in areas of fibrosis,i-IFTA)和肾小管萎缩区域内炎症与移植肾不良结局的相关性[3]。Matas等[20]在肾移植后90 d(n=598)的活检中检测了i-IFTA和萎缩区域的肾小管炎的影响,结果与这一结论相符。 i-IFTA是活性T细胞介导的同种免疫的组织学结果,代表炎症和肾小管损伤与纤维化愈合之间的界限,不受控制的i-IFTA参与介导纤维化等不良结构和功能改变过程[21,22]。此外,有学者研究了供者循环特异性抗HLA抗体(HLA-DSA)在移植肾间质纤维化的作用,结果提示,移植后携带HLA-DSA的患者与未携带HLA-DSA的患者相比,移植后1年及以上的活检显示IF/TA进展明显加快。循环HLA-DSA是早期和加速同种异体移植物纤维化的主要决定因素,并且独立于传统危险因素和抗体介导的排斥反应发挥作用[23]。

1.2.2 补体及凝血级联反应:补体增强了同种异体反应性T细胞免疫过程,导致移植排斥,并且介导间质纤维化形成。C3参与肾素-血管紧张素系统的激活和促进EMT,C5/C5aR的缺失(但不阻断膜攻击复合物形成)可以抑制肾脏间质纤维化形成[24,25]。凝血系统的激活与移植物的病理状况同样相关,可以通过与补体蛋白水解级联反应的复杂相互作用,介导先天免疫系统的激活,并通过其对树突状细胞的影响,参与同种抗原特异性适应性反应的扩增。因此,凝血和补体系统可能被视为调节先天免疫和防止进行性移植物损伤的潜在治疗靶点。靶向凝血和补体两种蛋白水解系统共有的作用点可能减少肾移植中先天性免疫系统的激活,减少其对移植物结构和功能的损害[26]。

1.2.3 缺血缺氧:肾移植过程中的缺血缺氧可引起移植物损伤,Heylen等[27]发现在经历缺血的所有同种异体移植物中DNA甲基化水平急剧增加,高甲基化可影响参与抑制肾损伤和纤维化的基因表达。而且,移植物植入前DNA高甲基化可预测移植后1年的慢性损伤,特别是间质纤维化和肾小球硬化。缺血再灌注损伤可导致急性肾损伤和移植肾功能延迟恢复(delayed graft function,DGF),促进间质纤维化发生。Heilman等[28]报道了供体来源的纤维化可能增加DGF的几率,但DGF似乎不会加剧移植后第1年纤维化的进展。

1.3 介导肾间质纤维化的信号通路 参与肾间质纤维化的信号通路众多,包括TGF-β1,Hedgehog信号通路、Wnt通路以及HIF-1和ROS等,已证实TGF-β1水平持续升高与促纤维化信号网络的激活有因果关系,TGF-β1是肾间质纤维化形成的主要驱动因素。TGF-β1可激活ALK5 I型受体以及非经典(如src激酶、EGFR、JAK/STAT、p53)通路,共同驱动纤维化基因组程序。HIGGINS等报道了小鼠肾小管中p53基因的敲除可防止上皮细胞G2/M期阻滞,减少纤维化效应细胞的分泌,并减缓急性至慢性肾损伤的转变[29]。Hong等[30]报道,损伤发生时,肾脏上皮和间质Notch1信号活化,通过激活下游TGF-β1/Smad2/3信号转导促进成纤维细胞向肌成纤维细胞分化,促进ECM沉积,介导间质纤维化。

1.4 免疫抑制剂与移植肾间质纤维化 免疫抑制剂在发挥免疫抑制效应的同时,其毒性损伤也是导致移植器官慢性失功的重要因素。经典的免疫抑制剂包括钙调磷酸酶抑制剂、麦考酚酸等,它们都会增加移植肾间质炎症和纤维化[31]。Xia等[32]研究发现通过抑制NLRP3炎性小体介导的TGF-β/Smad通路,可以保护环孢素A诱导的肾毒性和肾间质纤维化。Dao等[33]研究发现大麻素受体1(Cannabinoid receptor 1,CB1)在正常移植肾中低表达,但在CAD中高表达。在他克莫司诱导的肾小管间质纤维化形成的体外模型中,他克莫司可显著促进CB1的mRNA和蛋白表达。给予CB1拮抗剂利莫那班可减弱肾小管细胞合成胶原,减缓间质纤维化进展。

2 抗间质纤维化治疗进展

由于CAD的影响因素众多、机制复杂,对于CAD的治疗,临床上主要包括:调节饮食结构、降低激素和免疫抑制药物的剂量、应用血管紧张素转化酶抑制剂或血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂、调控血压和降尿酸等,尚无统一的标准治疗路径。因此,深入研究有效并且实用的抗间质纤维化防治策略是当前的重点难点。

2.1 细胞靶向 肾间质纤维化过程复杂,靶向参与间质纤维化形成过程中的细胞及其来源是研究抗纤维化治疗的一种基本策略。白藜芦醇通过靶向成纤维细胞活化和EMT,从而抑制单侧输尿管梗阻(Unilateral ureteral obstruction,UUO)所致纤维化模型中肌纤维母细胞表型和纤维化形成,并且抑制间质和小管中上皮细胞增殖相关信号通路(MAPK、PI3K/Akt、Wnt/β-catenin和JAK2/STAT3)的活性[15,34]。利拉鲁肽是一种长效胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物,在UUO间质纤维化模型中,利拉鲁肽结合并激活GLP-1受体,抑制TGF-β1/Smad3和ERK1/2信号通路的激活,减少ECM分泌和沉积,阻止EMT发生,起到减轻间质纤维化的作用[35]。

众多研究表明,干细胞治疗具有肾脏保护作用,Wang等[36]研究发现体外培养的脂肪间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells,AMSCs)诱导巨噬细胞表型从M1型转变M2型,在UUO间质纤维化动物模型中,AMSC治疗可以通过抑制间质炎症减轻纤维化的进展。 Xing等[37]研究表明骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)输注可抑制UUO诱导的肌成纤维细胞活化和增殖;此外,MSC减弱了UUO小鼠巨噬细胞的肾小管间质浸润,从而减轻间质纤维化;因此,干细胞治疗是一种有前景的抗间质纤维化策略。

调节性T细胞(Tregs)可以在移植免疫反应的急性期减轻间质炎症,逆转肾移植排斥反应,可能参与调节纤维化过程。Chandran等[38]对三名肾移植受者进行了一项自体Treg细胞治疗的安全性和可行性试验。结果表示在接受免疫抑制的肾移植患者中分离、扩增、输注Tregs是可行的。但参与者数量有限,无法检测移植物炎症的改善情况,也无法得出移植肾纤维化与Tregs输注之间的任何相关性。接下来,研究多克隆和供体同种抗原反应性Tregs治疗疗效以及Tregs有效性机制将是移植肾抗间质纤维化新的热点。

常规细胞治疗由于给药细胞的滞留较低,作用有限,效果欠佳。Oka等[39,40]最近报道了肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)转基因间皮细胞片移植在大鼠肾纤维化模型中表现出较强的治疗作用,转基因细胞片移植可增加肾脏活化HGF受体的表达并且通过微血管阻止了肾间质纤维化进展。因此,细胞片治疗是一种新的和有希望的策略。

2.2 分子靶向 血管紧张素Ⅱ促进血管收缩和醛固酮释放以升高血压,有促氧化、促炎和促间质纤维化作用。抑制肾素-血管紧张素系统(RAS)可减轻间质纤维化进展,血管紧张素转换酶抑制提供的保护作用可降低移植物中的毛细血管稀疏、淋巴管生成和足细胞损伤,减轻肾小球硬化和肾小管间质纤维化[41]。Nafar等[42]发现氯沙坦治疗可降低肾移植患者组织miR-21和TGF-β的表达,减轻组织间质纤维化,对移植肾功能有保护作用。但RAS阻断在肾移植受者中的益处仍有争议,最近的一项荟萃分析指出需要有>10 000受试者进行临床实验,结果才具有统计学意义[43,44]。

吡非尼酮(Pirfenidone,PFD)是一种以TGF-β和肿瘤坏死因子-α为靶点的抗纤维化、抗氧化和抗炎药物,已被批准用于特发性肺纤维化治疗。研究发现PFD对CAD的肾损伤同样具有保护作用,可以减轻移植肾间质炎症及纤维化程度[45]。然而,是否采用抗TGF-β治疗目前来说仍具有争议。

一方面,TGF-β是调节所有器官纤维化的关键介质,尤其是肾脏;另一方面,TGF-β调节多种生物学和病理学过程,阻断TGF-β将产生各种副作用,包括带状疱疹、脓疱性皮疹、出血疾病等[46]。β-连环蛋白(β-catenin)是大多数TGF-β信号通路中的共同辅助因子,β-catenin与T细胞因子(T cell factor,TCF)结合激活促纤维化基因,而与诱导的Tregs分化的转录因子Foxo结合,则促进细胞存活[47]。Qiao等[48]研究结果表明,抑制β-catenin /TCF介导的TGF-β促纤维化作用,同时增强β-catenin /Foxo介导的抗炎作用,可能是抗TGF-β治疗的策略之一。

近年来,对移植肾间质纤维化理解的一个重大转变是:认识到表观遗传标记物(在不改变DNA序列的情况下控制基因表达的调节过程)整合了引发间质纤维化的各种内在和外在调节机制。表观基因组代表遗传学和环境之间的融合,在移植的情况下,环境从供体转移到受体,从而提供表观基因组的明显改变,包括DNA甲基化模式、组蛋白修饰和非编码RNA(ncRNA)的作用,其中MicroRNA(miRNA)最近研究较多,可通过影响mRNA的转录后降解和抑制蛋白质的翻译来引起靶基因的抑制。

Matz等[49]报道了血浆样本中miR-21、miR-142-3p和miR-155的表达改变与同种异体肾移植功能障碍有关,并可用于肾移植中的移植物功能监测。有研究显示,IF/TA患者移植肾中miR-378的水平显著低于健康对照组,miR-378处理显著降低了缺血再灌注损伤后1 d的细胞凋亡率和肾小管损伤评分,减少了白细胞浸润,miR-378对移植肾IF/TA以及预防IRI具有潜在的保护作用[50]。

长非编码RNA(lncRNA)和miRNAs之间存在相互作用,许多学者正在研究这些循环生物标志物之间的复杂关系。随着大规模转录组分析的发展,我们现在已经认识到绝大多数基因组序列被转录成lncRNAs。在UUO间质纤维化大鼠肾脏中,促间质纤维化lncRNA HOTAIR显著上调,HOTAIR耗竭会上调miR-124以阻断Notch1信号通路,从而改善EMT并减少纤维连接蛋白和α-SMA等纤维化蛋白的累积[51]。lncRNAs对肾间质纤维化的调节作用是一个有前景的抗纤维化治疗靶点,然而,关于它的研究仍不深入。低表达量、种间保守性较低、功能复杂以及难以改变lncRNA在核或细胞质区室中的结构和位置等因素都阻碍了lncRNA治疗的发展。尽管如此,诸如CRISPR/Cas9编辑等新技术仍可能是未来肾脏疾病中调控lncRNA表达和功能的新方法[52,53]。

综上所述,CAD仍然是造成移植肾远期功能丧失的关键因素。到目前为止,已经确定了许多潜在的抗纤维化途径,但尚未有在移植肾脏中获批的抗纤维化药物。因为移植肾间质纤维化途径重叠并相互影响,其复杂性使抗间质纤维化药物研发较为困难;肾移植后表观遗传调节机制变化的发现对移植物结局的预测有重要意义。我们相信,在临床、生物标志物和新生物技术的结合将提高CAD的诊断精度和治疗效果,进而提高移植肾远期存活率。