焙烤及油炸食品中赖丙氨酸检测方法的建立及监测

潘强，李燕妹，梁敏，黄燕，吴丽倩，陈集元，蔡小明

（福建省产品质量检验研究院 国家加工食品质量检验检测中心，福建 福州 350002）

随着生活水平的提高，人们对食品的消费理念逐渐从吃饱吃好的生存型消费转变成健康、营养、多样化的享受型消费，越来越多的消费者追求吃得更健康、更安全。热加工是食品生产过程中必不可少的环节，其不仅能够赋予食品良好的口感、香味、外观，而且能够延长食品的保质期，但这一过程往往伴随着蛋白质变性、脂质氧化、维生素降解等，并生成一些有害物质[1,2]。赖丙氨酸就是食品热加工过程中产生的有害物质之一。富含蛋白质的食品经过高温[3-7]或碱处理[8-10]会产生赖丙氨酸，大量消耗掉食品中必需氨基酸，降低食品的营养价值[11,12]，同时螯合金属酶，使生物体内矿物质利用率降低，造成机体金属元素营养失调，此外赖丙氨酸还会对动物机体产生肾毒性[13]。目前在食品法规中没有明确表明赖丙氨酸的危害性及安全限量，但是在婴幼儿配方食品中，赖丙氨酸已经开始作为一个质量控制指标，以避免对婴幼儿造成伤害[14,15]。

焙烤及油炸类食品品种多样、味道各异，深受我国消费者喜爱，具有食用范围广、频率高等特点。目前，我国对食品中赖丙氨酸的研究主要集中在皮蛋[16]、牛奶[17-18]和婴幼儿配方食品，对于焙烤及油炸类食品中赖丙氨酸含量的检测及监控存在一定的空白。本文构建了焙烤及油炸食品中赖丙氨酸的氨基酸分析仪检测方法，该方法能够方便快速、准确地对焙烤及油炸类食品中赖丙氨酸含量的进行测定，有利于监测焙烤及油炸食品中的赖丙氨酸的含量，对保障消费者的食品安全具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

L-8900 氨基酸分析仪（日立公司）；电子天平（0.01 g，赛多利斯有限公司）；MS 3 basic微量振荡器（德国艾卡公司）；Avanti J-E高速冷冻离心机（赛默飞有限公司）；Milli-Q超纯水纯化系统（美国密理博公司）；全自动平行浓缩仪（睿科仪器有限公司）；DHG -9140A 恒温干燥箱（上海精宏试验设备有限公司）。

赖丙氨酸（1000 mg/L，CAS:4418-81-9）：天津阿尔塔科技有限公司。17种氨基酸混合标准溶液（2.50 μmol/mL）：富士胶片和光纯药株式会社东京工厂。

焙烤食品（面包、饼干等）和油炸食品（薯片、沙琪玛、麻花等）均为市售品。

1.2 标准溶液配制

将1000 mg/L的赖丙氨酸标准品用水稀释成质量浓度为0.50、1.00、5.00、10.0、50.0 mg/L的系列标准溶液。

1.3 样品前处理

1.3.1 样品直接酸水解

准确称取1.00 g（精确至 0.01g）粉碎后样品于25 mL水解管中，加入10 mL浓度为6 mol/L的HCl溶液，密封，110 ℃下水解24 h。

1.3.2 样品按脱脂、酸水解蛋白的步骤处理准确称取1.00 g（精确至 0.01g）粉碎后样品置于50 mL离心管中，加入正己烷10 mL，涡旋离心弃去正己烷层，重复上述步骤2次并氮吹去除正己烷。脱脂后的样品用浓度为6 mol/L HCl的溶液10 mL转移至 25 mL水解管中，110 ℃下水解24 h。

1.3.3 样品按脱脂、还原、酸水解蛋白的步骤处理

准确称取1.00 g（精确至0.01g）粉碎后样品置于50 mL离心管中，加入正己烷10 mL，涡旋离心弃去正己烷层，重复上述步骤2次并氮吹去除正己烷。脱脂后的样品加入10 mL硼砂盐缓冲溶液（0.2 mol/L）涡旋混匀，再加入1 mL硼氢化钠溶液（2.0 mol/L），混匀后4 ℃冷藏过夜。离心，弃去上清液。将样品用10 mL，浓度6 mol/L的HCl溶液转移至25 mL水解管中，110 ℃下水解24 h。

1.3.4 用水直接提取

准确称取1.00 g（精确至0.01 g）粉碎后样品于10 mL容量瓶中，加入5 mL水超声提取20 min，之后用水定容至10 mL，测定样品中游离的赖丙氨酸。

水解管取出自然冷却后将水解液转移至25 mL容量瓶中，并用水定容摇匀、过滤。准确分取5.00 mL滤液于10 mL比色管中，用质量分数为50%的NaOH溶液调pH值为5.0～6.0，用水定容至10 mL， 涡旋混匀备用。

1.4 仪器条件

1.4.1 氨基酸分析仪条件

色谱柱：HITACHI 阳离子交换柱（60 mm×4.6 mm×3μm）。

流动相：A相为柠檬酸钠溶液（0.020 mol/L，pH3.3）；B相为柠檬酸钠溶液（0.026 mol/L，pH3.2）；C相为柠檬酸钠溶液（0.045 mol/L，pH4.0）；D相为柠檬酸钠溶液（0.091 mol/L，pH4.9）；E相为再生液。柱后衍生剂：R1茚三酮溶液；R2缓冲液；R3乙醇溶液（5%）。

梯度洗脱程序为：0～2.5 min，100% A；2.6～5.0 min，100 %B；5.1～12.8 min，100% C；12.9～27.0 min，100%D；27.1～33.0 min，100%E；33.1～34.0 min，100 %B；34.1～53.0 min，100%A。（流速0.40 mL/min）。

衍生程序：0～32.0 min，50%R1+50%R2；32.1～37.0 min，100% R3；37.1～53.0 min，50 %R1+50%R2（流速0.35 mL/min）。

检测波长：570 nm；进样量：20 μL；柱温：57 ℃；衍生温度：135 ℃。

1.4.2 液相色谱-质谱条件

色谱柱：Waters BEH C18 (1.7μm，2.1 mm×100 mm)；流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为乙腈；进样量5 μL；流速0.4 mL/min；柱温40 ℃；梯度洗脱程序：0～5 min，95%～60% A；5.1～8 min，0%A；8.1～10 min，95% A。

离子源：电喷雾离子源（ESI-源）；离子源温度：350 ℃；监测模式：多反应监测模式；定量离子m/z 234.1＞84.1，定性离子m/z 234.1＞130.1。

2 结果与分析

2.1 系统适用性和专属性试验

分别取赖丙氨酸标液、赖丙氨酸及17种氨基酸混合标准品溶液、样品溶液按1.4.1的色谱条件进样测定，记录色谱图（图1）。从图1A、图1B可以看出，在1.4.1所示色谱分析条件下，赖丙氨酸和16种混合氨基酸均能实现基线分离，且分离度大于1.5。图1C显示，实际样品检测不存在干扰峰。综上，在该氨基酸分析仪的分析条件下，其他氨基酸组分或样品成分对赖丙氨酸含量的测定无干扰，表明所用方法的专属性良好。

图1 标准溶液（A、B）和样品溶液（C）的色谱图

2.2 前处理条件的优化

以薯片为样品，比较4种不同样品前处理方法对目标物检测结果影响（见表2）。结果表明，未经正己烷脱脂处理的样品（方法①）测得的赖丙氨酸含量与经过正己烷脱脂处理的样品（方法②）没有显著性差别（p＞0.05），未经正己烷脱脂处理的样品并未对赖丙氨酸造成干扰，但对前10 min出峰的氨基酸产生了干扰，影响了对其他氨基酸组分的同时监测，此外，焙烤及油炸食品油脂含量较高，为避免油脂对色谱柱的损害，需将样品进行脱脂处理。未经NaBH4还原处理的样品（方法②）测得的赖丙氨酸含量与经过NaBH4还原处理的样品 (方法③)没有显著性差别（p＞0.05），说明高温酸性水解过程并不会促使新的赖丙氨酸生成，使样品中赖丙氨酸的测定值偏高，因此无须对样品进行NaBH4还原处理。方法④未检测到样品中游离的赖丙氨酸，说明在食品中赖丙氨酸主要以结合态的方式存在，需要对样品进行水解才能得到赖丙氨酸。

表2 不同处理方式测得的赖丙氨酸含量（n=3）

2.3 方法学验证

2.3.1 标准曲线和检出限、定量限

配制 0.50～50.0 mg/L 的6个系列浓度点的赖丙氨酸标准溶液，按色谱条件（1.4.1）进行测定。以测定赖丙氨酸的质量浓度（X，mg/L）为横坐标，赖丙氨酸的峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线。结果表明，目标物在0.50～50.0 mg/L的线性范围内具有良好的线性关系，相关系数r为0.9999，标准拟合方程为y=1.75×105x+3.39×103。根据3倍信噪比和10倍信噪比计算出赖丙氨酸的检出限（LOD）和定量限（LOQ）分别为3.33 mg/kg和10.0 mg/kg。

2.3.2 加标回收率试验

试验发现烘焙及油炸类食品中均含有赖丙氨酸，因此取面包、薯片和饼干3类样品作为代表性样品，进行3水平3平行的加标试验，结果见表3。由表3可知，该方法加标回收率范围为86.3%～91.3%，RSD为1.47%～4.26%。可见该方法具有良好的准确度和精密度，适用于烘焙及油炸类食品中赖丙氨酸的测定。

表3 不同烘焙及油炸类食品中赖丙氨酸的加标回收率与相对标准偏差（n=3）

2.4 目标物的确证

氨基酸分析仪法采用保留时间定性，当检出结果存在不确定因素时，可采用LC-MS/MS进一步确证，仪器参数见“1.4.2”，其多反应监测（MRM）图见图2，赖丙氨酸目标物可能裂解途径见图3。

图2 赖丙氨酸的MRM图

图3 赖丙氨酸可能裂解途径

2.5 实际样品检测

应用本方法对市售面包、薯片、饼干、麻花、蛋糕及沙琪玛共计30批次样品进行检测，试验结果如表4所示。

表4 市售焙烤及油炸类食品中赖丙氨酸的实测含量（n=3）

实验结果表明，油炸类食品中赖丙氨酸的含量远高于焙烤类，油炸类食品薯片、麻花和沙琪玛等中赖丙氨酸含量在79.5～250.7 mg/kg之间。焙烤类食品面包、蛋糕、饼干赖丙氨酸的含量在 11.2～101.6 mg/kg之间。结果也表明同类食品中生产工艺的不同，如加热温度的高低、时间的长短等也会使产品中赖丙氨酸含量有很大区别，如采用较低温度制作的蒸蛋糕（蛋糕1和蛋糕5）中赖丙氨酸的含量明显低于高温烘烤的蛋糕（蛋糕5）。

目前，国家食品安全标准尚未对赖丙氨酸含量进行限制，但其潜在的危害性不容小觑，因此，建议有关部门对焙烤及油炸类食品中的赖丙氨酸进行监测，促使生产企业优化生产工艺条件，减少生产过程中赖丙氨酸的生成。

3 讨论

赖丙氨酸的形成机制主要包括2步：第一步是蛋白质中的胱氨酸、半胱氨酸、丝氨酸或磷丝氨酸残基通过β-消除反应生成脱氢丙氨酸残基；第二步是含有共轭双键的脱氢丙氨酸残基与蛋白质中的赖氨酸残基ε-氨基发生交联反应生成赖丙氨酸[16,20]。加热和碱处理是形成赖丙氨酸的2大因素，随着研究深入，发现食品加工方式、食品组分、灭菌方式、食品储存条件等都会促使赖丙氨酸的生成，但赖丙氨酸形成是可以在食品加工过程中通过控制加工工艺进行控制。如适度降低pH值，减少游离氨基酸的生成，控制蛋白质交联反应的发生[8,10]；在保证食物质量的基础之上，降低加热温度，缩短加热时间[17,21]；在生产过程中加入碳水化合物使其与蛋白质发生美拉德反应，消耗赖氨酸的ε-氨基[22]；使用高压条件使蛋白质分子空间结构产生变化，阻碍氨基酸之间的交联；减少产品的货架期[23]等均能有效控制食品加工过程中赖丙氨酸的产生。

4 结论

本文建立了焙烤和油炸食品中赖丙氨酸的氨基酸分析仪检测方法。该检测方法赖丙氨酸的定量限为10.0 mg/kg，加标回收率为86.3%～91.3%，相对标准偏差（RSD）为1.47%～4.26%，方法简便、准确、稳定，还可以同时测定多种氨基酸，可应用于焙烤和油炸食品中赖丙氨酸含量的测定，对优化食品加工工艺条件、保证食品安全及保障消费者身体健康具有重要的指导意义。