改良抗酸染色和结核与非结核基因检测在结核病病理诊断中的应用比较

彭海英　曾江　张润兰　陈芮　赖小菊

【摘要】  目的    比較分析改良抗酸染色和结核与非结核基因检测在结核病病理诊断中的差异。方法    收集赣州市第五人民医院2020年1—12月确诊肺结核患者96例，组织经病理常规取材、石蜡包埋、切片、苏木精-伊红（HE）染色，之后进行改良抗酸染色与结核与非结核基因检测。结果    96例肺结核患者病理中，抗酸染色阳性例数48例，阳性率50%；结核与非结核基因检测结核阳性例数70例，阳性率73%，差异有统计学意义（P<0.05）；两种方法联合检测阳性例数75例，阳性率78%，与基因检测相比，差异无统计学意义（P>0.05），与改良抗酸染色相比，差异有统计学意义（P<0.05）。结论    在结核病病理诊断中，结核与非结核基因检测阳性率显著高于改良抗酸染色法，两种方法联合检测更有利于提高确诊率。

【关键词】  结核； 病理诊断； 改良抗酸染色； 结核与非结核基因检测

Application comparison of modified acid fast staining and tuberculosis and non-tuberculous gene detection in the pathological diagnosis of tuberculosisPeng Haiying，Zeng Jiang，Zhang Runlan，Chen Rui，Lai Xiaoju.The Fifth People's Hospital of Ganzhou City，Ganzhou，Jiangxi  341000

【Abstract】  Objective    To compare and analyze the differences between modified acid fast staining and tuberculosis and non-tuberculous gene detection in the pathological diagnosis of tuberculosis.Methods    A total of 96 cases of patients with pulmonary tuberculosis diagnosed in Ganzhou Fifth People's Hospital from January 2020 to December 2020 were collected. The tissues were routinely collected by pathology， embedded in paraffin， sectioned， and stained with HE， and then subjected to improved acid-fast staining and comparison of tuberculosis and non-tuberculosis genetic testing.Results    Among the 96 cases of pulmonary tuberculosis patients， 48 were positive for acid-fast staining， with a positive rate of 50%. Tuberculosis and non-tuberculous genetic testing were 70 positive for tuberculosis， with a positive rate of 73%. Compared with the two methods， The positive rate of tuberculosis and non-tuberculosis gene detection was significantly higher than that of the modified acid-fast staining method， and the difference was statistically significant； the number of positive cases detected by the two methods was 75， and the positive rate was 78%. Compared with the genetic test， the difference was not statistically significant. Compared with staining， the difference is statistically significant.Conclusion    Among the two detection methods for pathological diagnosis of tuberculosis， the positive rate of tuberculosis and non-tuberculous gene detection is significantly higher than that of the modified acid-fast staining method. The combined detection of the two methods is more conducive to clinical diagnosis，worthy of clinical promotion.

【Key Words】  Tuberculosis； Pathological diagnosis； Modified acid fast staining； Tuberculosis and non-tuberculous gene detection

中图分类号：R378.91        文献标识码：A        文章编号：1672-1721（2023）20-0075-03

DOI：10.19435/j.1672-1721.2023.20.025

结核病是由结核分枝杆菌感染引起的一种慢性传染性疾病，是全球单一病原体感染导致死亡的第九大原因，严重危害人类健康，是世界范围内的主要公共卫生问题。尤其是近年来由于人类免疫缺陷病毒（HIV） 感染、空气污染等因素影响，发病率逐年增高。因此，结核病患者的早期诊断和治疗，已成为我国传染病防治的重要工作[1]。病理诊断方面，典型的结核病变为由干酪样坏死、类上皮样细胞和朗格汉斯细胞形成的结核样坏死性肉芽肿，显微镜下容易识别，但由于抗生素滥用、HIV感染、环境污染等因素引起结核杆菌变异，使结核病变组织形态学不典型[2]。因此，对于结核病的诊断，尤其是病理形态不典型的结核诊断来说，在石蜡组织切片中找到结核杆菌具有重要意义。而结核与非结核基因检测能从分子水平检测出组织中的结核与非结核分枝杆菌，技术上十分先进和成熟。本文旨在分析改良抗酸染色和结核与非结核基因检测在结核病病理诊断中的差异，从而为临床结核病的有效诊断提供参考。

1    资料与方法

1.1    研究对象    收集赣州市第五人民医院2020年1—12月确诊为肺结核患者96例，所有病理组织标本均经4%中性甲醛固定5～6 h，病理常规取材、脱水、包埋、切片、苏木精-伊红（HE）染色，之后进行改良抗酸染色和结核与非结核基因检测。

1.2    方法

1.2.1    改良抗酸染色    染色试剂为珠海贝索的抗酸染色试剂套盒，组织切片经脱蜡后不经酒精入流水稍冲洗；用吸水纸抹去切片周围液体至切片稍湿润；流水冲洗2 min；0.3% TritonX-100 液处理10 min，流水冲洗2 min；石炭酸复红溶液室温下染色20～30 min；流水洗去多余染液；滴加酸性酒精溶液分化3～4次，至切片呈无色为止；流水冲洗2 min，加亚甲基蓝溶液染20～30 s，流水冲洗2 min，晾干、封片。于显微镜下进行结果判读： 抗酸染色阳性分枝杆菌镜下一般呈红色、两端钝圆稍弯曲的杆状，有时呈串珠状，长1～4μm，可散在或呈片状分布，细胞核及背景呈淡蓝色。见封三图1—图2。

1.2.2    结核与非结核基因检测    检测试剂盒为成都博奥晶芯生物有限公司的分枝杆菌核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）。（1）组织连续切片15～20片后，置于离心管中。（2）溶蜡处理后，加入4倍体积4% NaOH液化。（3）30 min后吸取液化后的样本1 mL置EP管内，12 000 r/min离心5 min，弃上清液。（4）加入1 mL洗液于EP管中，充分涡旋震荡后12 000 r/min离心5 min，弃上清液。（5）加入50 μL核酸提取液，充分涡旋震荡后，将液体与沉淀转移至核酸提取管中，置入核酸提取仪，最大转速震荡10 min。（6）将核酸提取管转至95 ℃水浴锅中放置加热5 min，12 000 r/min离心1 min，取上清液进行扩增反应。样本检测时均设阳性对照和阴性对照。同时选择FAM通道和HEX通道，荧光采集点选择60 ℃ 30 s。扩增过程中仪器实时检测荧光信号并分析增长曲线。结果分析：试剂盒的参考值为40，样本扩增曲线呈S形，且Ct值小于40的样本，判定为阳性；扩增曲线不呈S形或Ct值为40（或无任何数值）判定为阴性。

1.3    统计学方法    采用SPSS 19.0统计学软件分析数据，计数资料以百分比表示，行χ²检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2    结果

2.1    临床病理学特征    96例肺结核患者中男性57例，女性39例，年龄为15～84岁，其中肺内结核患者58例（60%），胸膜结核患者18例（19%），肺及胸膜外结核患者20例（21%）；镜下表现为坏死性炎改变者38例，肉芽肿性炎改变者58例。

2.2    改良抗酸染色与结核与非结核基因检测结果比较    96例肺结核患者病理中，抗酸染色阳性例数48例，阳性率为50%；结核与非结核基因检测结核阳性例数70例，阳性率为73%，差异有统计学意义（χ²=10.642，P=0.001）。兩种方法联合检测阳性例数75例，阳性率78%，与基因检测法相比，差异无统计学意义（χ²=0.704，P=0.401），与抗酸染色法相比，差异有统计学意义（χ²=16.492，P<0.001），见表1。

3    讨论

结核病是由结核分枝杆菌复合群感染引起的一种世界范围内流行的传染性疾病，严重危害人类健康。2021年10月14日世界卫生组织（WHO）发布了《2021年全球结核病报告》[3]，报告中指出，全球结核潜伏感染人群近20亿，2020年，全球新发结核病患者987万，发病率为127/10万。2020年我国估算的结核病新发病例数为84.2万，结核病发病率为59/10万，我国估算结核病发病数在30个结核病高负担国家中排第2位，仅次于印度（259万），结核病死亡率为2.1/10万。虽然近年来我国结核病发病率和死亡率有所下降，但因感染人群基数大、医疗设施缺乏以及其他社会因素的限制，中国结核病的防控工作仍面临巨大挑战。因此，早期、快速、准确诊断是结核防治的关键。近年来，结核病的实验室诊断技术经过不断创新取得了较大的进展，尤其是分子检测技术的应用更是带来了革新。

结核感染可累及全身多个脏器，其中以肺最为常见。结核病常见的实验室诊断方法包括抗酸染色涂片镜检法、结核菌素试验、干扰素释放试验、结核分枝杆菌培养以及结核分子检测等[4]。而病理学作为一种诊断结核病的重要途径，尤其在菌阴肺结核及肺外结核等疑难病例诊断中起到了重要作用。结核分枝杆菌引起的慢性炎症为一种特异性感染，可引起Ⅱ型变态反应和Ⅳ型变态反应，表现为炎症的3种基本病理变化：渗出、坏死和增生，可以同时存在，或以某一种改变为主，且经常相互转化[5]。结核病的组织学镜下特点为上皮样肉芽肿性炎，在显微镜下表现为大小不等和数量不同的结节性肉芽肿。典型的结核结节中央见干酪样坏死，坏死周围可见上皮样细胞和（或）朗格汉斯巨细胞，外周有增生的纤维结缔组织和慢性炎细胞浸润，有时亦可见缺少肉芽肿病变的干酪样坏死结节[5-6]。在本次研究的96例样本中，表现为肉芽肿性炎的病例为58例（60.4%），而仅表现为干酪样坏死的病例38例（39.6%）。然而，除结核感染外，肉芽肿性病变也可出现在其他一些感染性疾病或非感染性疾病，如非结核分枝杆菌感染、真菌病、结节病、肉芽肿性血管炎等，需通过其他方法进行鉴别[6-7]。

抗酸染色法作为结核分枝杆菌的主要检测方法，其快速、简易、价廉，深得各实验室的推崇。本实验室所采用的改良抗酸染色，石蜡切片厚度为6μm，既可以增加切片中菌体的含量，又能清晰观察抗酸杆菌的形态；染色之前采用TritonX-100进行打孔处理，增加了细胞壁对染色剂的通透性，提高染液的渗透率，使胞内菌更好地进行着色，提高了敏感性和检出率[8]。本研究抗酸染色阳性例数为48例，抗酸阳性杆菌主要存在于组织的坏死区域或坏死与上皮样肉芽肿的交界处。然而，除结核分枝杆菌外，还有非结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌、部分努卡菌和军团菌属也可显示抗酸染色阳性[6]，仍需进一步进行鉴别。

近年来，随着分子生物学的迅猛发展，建立在核酸扩增基础上的分子病理检测技术已经获得WHO的认可，结核分枝杆菌的分子检测技术也日益先进，结核与非结核分枝杆菌检测由此而生。相对于其他方法而言，分子检测具有简单、快速、敏感、特异等优点，可有效提高组织样本中结核分枝杆菌检出率[9]。利用聚合酶链反应（PCR）检测技术对石蜡包埋组织中的结核分枝杆菌DNA进行检测，并通过与其他抗酸杆菌的鉴别，特别是在一些陈旧性病变，其结核病理形态学不典型，仅表现为凝固性坏死或纤维增生性病变，抗酸染色难以查找到抗酸杆菌。采用PCR检测方法对结核杆菌进行检测，鉴别诊断出结核与非结核分枝杆菌，实现结核病的精准诊断[5]。当然，由于部分标本含菌量较低，活检组织前期处理不当导致DNA降解、分子检测操作时NaOH消化时间过长发生RNA降解，以及组织经常规HE和其他检测损失较多等，均会影响结核分枝杆菌的基因检测结果，因此需要专业人员进行操作，以减少组织损耗，提高阳性率[3，10]。

值得指出的是，作為结核与非结核分枝杆菌核酸检测的补充——基因芯片法，提供了利福平和异烟肼的耐药性检测以及非结核分枝杆菌菌种鉴定。基因芯片技术于20世纪90年代开始应用于结核病的诊断。其将大量探针固定于特殊载体上，之后与待测样本的核酸进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度而获取样本分子的数量和序列信息。基因芯片法具有高通量、快速、灵敏度高、准确等特点，可以进行非结核分枝杆菌菌种鉴定以及结核分枝杆菌的耐利福平基因 rpoB和耐异烟肼 kat G、inhA 基因常见突变位点检测，为临床快速诊断分枝杆菌感染、指导临床用药提供可靠依据[11-12]。

综上所述，改良抗酸染色法操作简单、快速、价廉，一直为结核病诊断最常规的检测方法；而结核与非结核基因检测重复性好、结果可靠，敏感度高，能鉴别出结核与非结核分枝杆菌感染，在此基础上进行结核耐药性检测以及非结核分枝杆菌菌种鉴定。因此，基于显微镜镜下形态学的典型结核改变，借助于抗酸染色法和结核与非结核基因检测病原学证据的应用，可能是结核病病理诊断的模式之一，为临床结核病的诊断和指导用药提供重要参考依据。

参考文献

[1]    林晓.抗酸染色与荧光定量PCR检测在石蜡组织结核病病理诊断中的比较[J].临床与实验病理学杂志，2019，35（3）：356-357.

[2]    张继伟，李钦丽，聂秀.石蜡包埋组织结核分枝杆菌检测方法的对比分析[J].临床与实验病理学杂志，2021，37（3）：362-365.

[3]    卢春容，房宏霞，陆普选，等.WHO 2021年全球结核病报告：全球与中国关键数据分析[J/CD].新发传染病电子杂志，2021，6（4）：368-372.

[4]    曾江，肖南昌，彭海英.HIV/AIDS合并菌阴肺结核患者T-SPOT.TB与结核抗体的诊断价值比较[J].实验与检验医学杂志，2018，36（2）：199-200.

[5]    中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.WS 288—2017肺结核诊断标准[S].北京：中国标准出版社，2017.

[6]    王恩华，张杰.临床病理诊断与鉴别诊断——气管、肺、胸膜及纵隔疾病[M].北京：人民卫生出版社，2018：402.

[7]    李雪，孟禹彤，周翔，等.结核病病理诊断的新方法研究[J].诊断病理学杂志，2020，27（5）：300-305.

[8]    曾江，彭海英，朱俊芳.沉降式制片技术与改良抗酸染色应用于脑脊液找抗酸杆菌的分析[J].基层医学论坛，2018，22（4）：525-526.

[9]    李俊明，徐炜.结核病的分子诊断——进展与挑战[J].实验与检验医学杂志，2020，38（6）：1039-1046.

[10]    岳永宁，范大鹏，张艳，等.三种结核分枝杆菌分子检测技术诊断肺结核比较[J].预防医学，2019，31（5）：537-540.

[11]    何珍，王璞.结核实验室诊断技术研究进展[J].现代医药卫生，2018，34（21）：3336-3339.

[12]    冉兵，蔡林.基因芯片检测耐利福平结核分枝杆菌准确性的Meta分析[J].中国防痨杂志，2015，37（1）：56-65.

（收稿日期：2023-04-14）