第三方核酸检测实验室核酸污染防控策略概述

李敏　许友强　刘静　贾全胜

【摘要】  为确保聚合酶链反应（PCR）实验结果数据的真实性、准确性，也为保证实验人员的安全性，制定严格的实验室核酸污染防控策略尤为重要。本文以第三方检测机构新冠核酸PCR实验室大量核酸检测实验的经验总结为例，阐述第三方核酸实验室依靠严格的实验室功能分区，完备的实验室配套设施，合格的实验操作人员和严谨、科学的质量管理体系，并对污染进行定期监控和评估，在很大程度上能够控制、避免和减少核酸污染。

【关键词】  第三方核酸检测实验室；核酸污染；预防；控制

中图分类号：R115        文献标识码：A

文章编号：1672-1721（2023）01-0087-04

DOI：10.19435/j.1672-1721.2023.01.029

2019年底至今，席卷全球的新型冠狀病毒肺炎疫情，让第三方医学检测机构成为战疫中新冠病毒核酸检测的“主力军”，金域医学作为全国最大的第三方检测机构，2020年累计新冠核酸检测量超过3 200万人份，约占同期全国总体核酸检测量1/10。这庞大的检测数据意味着疫情之下，当面临大量核酸检测需求时，第三方医学实验室切实发挥了重要作用。

目前我国二级以上综合医院都具备核酸检测能力，也都相应设立了聚合酶链反应（PCR）实验室，高强度的核酸检测任务已然成为了医检人员的工作常态。而一旦出现实验室污染，可能会造成假阳性结果，导致检测结果不可信，甚至会危及实验室工作人员安全，应对核酸检测实验室污染的最好方法就是防范于未然。新疆金域PCR实验室运行至2021年9月，已完成将近189万人次的核酸样本检测，作为新冠病毒核酸定点检测机构，在监控和解决核酸污染方面积累了大量的实践经验。本文探讨分析了核酸检测实验室如何避免和减少核酸污染的产生以及污染处理策略，以供参考。

1    核酸污染防控基本要求

1.1    严格的实验室功能分区    通过在实验室设计建造、使用个体防护设施、严格遵从标准化工作及操作程序和规程等方面采取综合措施，确保实验室工作人员及周围环境不受实验对象的污染。按照《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》[1] （卫办医政发〔2010〕194号）规定，PCR实验室必须进行分区，每个步骤都在相应的实验区进行，原则上应设置以下区域：试剂储存和准备区、样本制备区、扩增和产物分析区，每个区设置专一标识，流转顺序为试剂准备区 → 核酸提取区 → 扩增区 → 产物分析区。根据使用仪器的功能，部分区域可适当合并，各区域在物理空间上应当是完全独立的。传递窗满足密封性要求，不能有空气直接相通。 试剂、样本等在各区之间以相应传递窗单向传递 ，严禁人员、器材和试剂倒流。各区均设有缓冲间，工作服和清洁消毒物品不得跨区混用。

各项检测工作应严格按相应规定在各自的区域内进行，严禁在样本制备区配制试剂。《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》（试行第八版）中明确提出：“在相对封闭的环境中长时间暴露于高浓度气溶胶情况下存在经气溶胶传播的可能”[2]。可见，实验人员在进行新冠核酸检测过程中，若防护不当，不慎接触新冠气溶胶病毒也易感染新冠肺炎。核酸检测实验室的人、物及空气流向都须严格按照试剂储存和准备区→样本制备区→扩增和产物分析区方向，空气压力递减的方式进行，防止扩增产物随人流、物流及空气流进入扩增前的区域，避免交叉污染。

1.2    完备的实验室配套设施    核酸检测中，PCR实验室所需的设备配置对检测结果的可靠性、准确性和安全性起到至关重要的作用，因此，越来越得到重视。由于PCR实验室所使用的检测方法可以测出普通检验难以检测出的病毒，并具有灵敏度高、特异性高、快捷、对样品要求低等优点，因此广泛应用于医院的临床诊断。完备的实验室配套设施是保证实验工作的必要条件，应根据各个实验室实验内容的不同配备相应的设备和仪器。试剂准备区、标本制备区、扩增区、分析区仪器设备必须满足正常实验开展所需，在确保检测实验顺利完成的前提下，尽量实现高自动化、高检测通量、高信息化。工作区域仪器设备参考配置标准如下：

1.2.1    试剂储存和准备区：2～8 ℃和-15 ℃冰箱、混匀器、微量加样器（覆盖1～1 000μl）、移动紫外灯、消耗品（一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离心管、加样器吸头）、专用工作服和工作鞋、专用办公用品等。

1.2.2    标本制备区：2～8 ℃冰箱、-20 ℃或- 80℃冰箱、高速合式冷冻离心机、混匀器、水浴箱或加热模块、微量加样器（覆盖1～1 000μl）、紫外灯、超净工作台、清耗品（一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离心管和加样器吸头），如需处理大分子DNA，应备有超声波水浴仪。

1.2.3    扩增反应混合物和扩增区：核酸扩增仪、微量加样器（覆盖1～1 000μL）、紫外灯（近工作台面）、消耗品（一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离心管和加样器吸头）、专用工作服和工作鞋、专用办公用品等。

1.2.4    扩增产物分析区：视检验方法不同而定，基本仪器设备如下：微量加样器（覆盖1～1 000μl）、紫外灯（近工作台面）、消耗品（一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离心管和加样器吸头）、专用工作服和工作鞋、专用办公用品等。

1.3    合格的实验操作人员    WHO《实验室生物安全手册》第四版，将实验室生物安全防护要求分为“核心要求”“加强要求”“最高要求”，主要是基于生物因子和人员能力的评估而确定，实验室的建设、运行、监管和评价需要高水平的专业人员、监管人员和评审人员。

通常情况下，PCR实验室工作人员应为医学检验专业或医学相关专业毕业，具备大专以上学历。技术人员必须是受过专业教育的技术人员，在独立承担检测任务前须在中高级实验技术人员指导下进行上岗培训，达到合格标准方可开始工作。根据《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》第十四条规定：“医疗机构临床基因扩增检验实验室人员应当经省级以上卫生行政部门指定机构技术培训合格后，方可从事临床基因扩增检验工作”[1] ，所有核酸检测人员需持PCR上岗证上岗，必须进行岗前培训（包括实验技能培训和生物安全培训）并经考核合格后方可进行检测工作，检测过程全程严格按照实验室标准操作规程（SOP）进行操作；实验室工作人员必须严格执行《核酸实验室设置与管理规范》的管理，遵守实验室的所有制度、规定和操作规程；实验室工作人员必须被告知實验室工作的潜在危险并接受实验室安全教育，自愿从事实验室工作。对于新进入本室的人员，如尚未取得PCR技术培训合格证，应在实验室有培训合格证的上级技术人员指导下进行实验工作，实验报告由有资格人员出具，并应在最短的时间内取得上岗培训合格证。此外，PCR实验室根据工作需要配备足够的工作人员，视工作量的增加和业务发展需要，适当增加工作人员。

1.4    严谨、科学的质量管理体系    根据实验室的具体情况编写质量体系文件《质量手册》《程序文件》《作业指导书》，并保证管理体系有效运行。管理体系的特点应有明确的目的、规范的管理、有效的制约、高效的机制、能自我发展的整体。依据《实验室生物安全通用要求》《病原微生物实验室生物安全管理条例》《生物安全实验室建设技术规范》等文件建立完备的实验室生物安全管理体系。为保证实验室检测工作的生物安全性，实验室应将政策、制度、计划、程序和指导书制订成文件，并传达到全体实验室人员。生物安全管理体系应始终贯穿于实验室活动的整个过程，从采样开始到所有潜在危险材料被处理。

实验室人员严格执行《核酸实验室设置与管理规范》的管理，尽量减少在实验区内不必要的走动以减少交叉污染的可能性；核酸实验室废弃物严格按照《医疗废物管理程序》执行，废液不能直接在实验室中倾倒；扩增产物分析区可能会用到某些可致基因突变和有毒物质，应特别注意实验人员的安全防护[3]。

2    污染的类型和处理方式

PCR反应虽然具有较强的扩增能力和极高的灵敏度等优点，但也存在极易污染的棘手问题，极其微量的污染都可能造成假阳性结果。如果形成气溶胶污染扩散，则可导致整个PCR实验室污染，处理起来非常棘手，严重时甚至要关闭实验室。核酸实验室具备超强的扩增能力、高检测灵敏度，因而极其微量的污染都会导致假阳性结果出现，所以防污染策略的实施尤为重要。实验室日常管理一定要做好清洁消毒工作，不能因为工作熟练就松懈下来，每日PCR实验前和实验后一定要按要求对实验室进行彻底的清洁消毒，避免造成二次污染，甚至更严重的人员健康或其他经济损失。一旦出现污染情况要尽快处理，核酸实验室常见的污染有：样本之间的交叉污染、试剂污染、扩增产物污染、克隆质粒污染，以及半开放核酸提取仪提取过程造成的交叉污染等，各类型污染均会给实验室带来假阳性结果的风险。

2.1    针对试剂污染，可分为：移液器污染，配制容器污染，其他溶液污染，阴阳性对照和标准品混放导致的污染等。可以采取以下防范措施：配备专用移液器用于配制试剂，不得与加质控品、样本的移液器混用；配制试剂用的容器、EP管等务必为无菌管、不含RNA降解酶等；配制人员做好二级防护，避免体液毛发等污染试剂；配制试剂一定要遵守现配现用原则，以及配好的试剂密封。

2.2    针对样本污染，可分为：样本之间的交叉污染，气溶胶污染，阳性质控污染，提取好的模板之间的交叉污染等。根据以上情形可以采取以下防范措施：操作时，要勤更换一次性手套，防止在加液和移液时发生滴液、漏液，进而污染工作台面和其他样本；开样本管盖时小心操作、开EP管盖前稍离心收集液体于管底；在加入模板时，按照“阴性对照-待测样品-阳性对照”的加样顺序。

2.3    针对核酸气溶胶污染，可分为：阳性样本、阳性质控或标准品气溶胶和扩增产物气溶胶两种情况，一般常发生在EP管爆盖时、剧烈震荡时、高速离心时、移液器反复吹打时。可以采取以下措施：对实验室环境以及重污染区进行封闭，同时对区域内被气溶胶污染的相关设备、耗材等，用布或纸巾覆盖并由外围向中心倾倒0.5%的次氯酸消毒剂，约30 min后，清除污染物品，再用0.2%次氯酸消毒剂擦拭，然后用75%酒精进行喷洒，最后开启固定紫外灯、使用移动紫外车定点照射1 h，照射结束后有条件的应开窗通风（通风前做好其他未污染区域的防范）。在进行去污消杀的同时，需做好环境、物表和操作人员手表核酸监测与评估，上述去污措施可反复多次进行，通过核酸监测发现去污措施无效时，应更换实验场地或者使用不同引物的扩增试剂。核酸气溶胶污染不是瞬间产生的，而是一个累积的过程，在日常实验过程中严格按照相关要求进行清洁消毒，遵守实验室各区独立、物品严格分区、人流和气流单一流向原则，在很大程度上可规避核酸气溶胶污染[4]。

进行PCR检测实验操作时，操作人员必须严格遵守操作规程，最大程度地降低可能出现的PCR检测过程中污染。实验室一旦发生污染，检测工作应立即停止，污染的实验结果必须作废，直到确认污染消除后才能重新开始检测。首先，要查找污染源和明确污染范围，根据污染源和污染范围采取最有效的去污染措施，结合各种不同方法以达到最佳效果。规范的实验操作包括：实验应在超净工作台进行，工作台内应放置PCR专用微量离心机、各量程移液器和其他必需物品；实验过程中选择最合适尺寸的手套并及时更换，在进出不同实验区域时都应更换实验服、口罩及手套，以避免不同实验区交叉污染；装有PCR试剂的反应管在打开之前应先瞬时离心，将管壁及管盖上的液体离至管底，降低污染手套或加样器的风险；谨慎开启反应管，防止管内液体溅出或形成气溶胶导致污染；吸加试剂和模板的操作遵守“慢吸快打”原则，尽量一次性完成，忌多次抽吸，以避免气溶胶产生的交叉污染。PCR试剂建议小量分装，以减少反复冻融、重复取样次数；多样本PCR反应时，先配制反应混合液分装至反应管中，最后加入样本核酸，且勿同时开盖，尽量保证单人单管，实现完全闭管操作；实验试剂应与样品和PCR产物分开保存，不应放于同处；PCR扩增实验完成后及时将反应管取出，用一次性手套将产物反应管包裹丢弃，保证管盖紧闭。

3    污染的定期监控和评估

2021年3月，西安某新冠肺炎定点医院一位负责隔离病区患者核酸检验的工作人员被诊断为确诊病例。除了一线医务人员，身为第三方医检机构的核酸检测人员，长期暴露在高危的病毒检测环境中，所承受的压力和风险也是常人无法想象的。

一个合格的PCR实验室要时刻注意污染的监测，以防遇到任何污染，在第一时间能够及时采取有效解决措施。为保证实验室工作人员不受实验对象的感染，周围环境不受实验对象的污染，做好核酸实验室核酸污染的定期监控工作很有必要，常规定期监控要求做到：每天进行实验室空气采样监测，定期对实验室台面、门把手、仪器设备表面等进行取样监测；每次检测过程采用至少3个阴性对照随机置放参与提取全过程；针对阳性样本，实验室应当建立严格的可疑样本和阳性样本复检流程，选用另外1～2种灵敏度更高且扩增不同区域的检测试剂对原始样本进行复查检测。安排实验人员记录阳性率及假阳性的发生频率，针对检测过程中发现阳性率异常升高、阴性对照频繁出现假阳性、未知扩增条带重复出现等问题，很可能发生了核酸气溶胶污染，应立即进行污染源的排除和清理。

除了日常的防污染监控，还应对所在实验室的风险因子进行定期评估，并制定避免危险生物因子造成实验室人员暴露，防止向实验室扩散并导致危害的相应预防措施。WHO第四版手册[5]对实验室的生物安全防护要求主要是基于生物因子和人员能力的评估而确定，以确保实验室工作人员不受实验对象的感染，周围环境不受实验对象的污染。

本医学检验所作为在当地卫健委备案的独立法人第三方检验检测机构，为社会及政府提供各类优质的医学检测服务、公证的数据，并出具具有法律效力的检测报告。检验所检测水平的高低直接影响到企业的声誉，PCR检测作为目前新冠病毒流行大背景下日常检测的重点项目，更应该保证其检测结果的真实性和准确性。因此，检测过程中必须严格执行标准操作规程，提高防止交叉污染的意识，降低出现假阳性结果的风险，做好实验室日常清洁消毒和环境监测工作，保证实验检测及相关人员的生物安全性。

参考文献

[1]    医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法（卫办医政发〔2010〕194号）[S].国家卫生部办公厅，2010.

[2]    新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第八版）（国卫办医函〔2020〕680号）[S].国家卫健委，2020.

[3]    曾勁峰.核酸实验室污染原因分析及污染控制对策[EB/OL].https：//wenku.baidu.com/view/351a46eaff4733687e21af45b307e87101f6f8fa.html

[4]    医疗机构新型冠状病毒核酸检测工作手册（试行第二版）（联防联控机制医疗发〔2020〕271号）[S].国务院应对新型冠状病毒肺炎疫情联防联控机制医疗救治组，2020.

[5]    张彦国.WHO《实验室生物安全手册》（第4版草案）简介[J].暖通空调，2020，50（6）：81-85.

（收稿日期：2022-10-18）