荧光定量PCR法在乙型肝炎病毒检测中的准确性评价

张黎

【摘要】  目的    分析荧光定量聚合酶链式反应法（FQ-PCR）应用在乙型肝炎病毒（HBV）检测中的准确性。方法    选择2020年1月—2021年6月接诊的100例HBV携带者，均行FQ-PCR、酶联免疫吸附法（ELISA）检测，对比二者检测结果。结果    100例HBV携带者中“大三阳（模式1）”共24例，HBV-DNA含量平均为（8.24±1.12）copy/mL，阳性率为95.83%（23/24），均显著高于其他6种模式（P<0.05）；100例HBV携带者中“小三阳（模式2）”共31例，HBV-DNA阳性率为83.87%（26/31），均显著高于3，4，5，6，7模式（P<0.05）；而其他模式在HBV-DNA阳性率及含量方面均无明显差异（P>0.05）。结论    与ELISA相比较，FQ-PCR更能定量反映HBV复制、感染状况，有助于早期确诊乙型病毒性肝炎，以及判断传染性质与监测病情，值得推广。

【关键词】  荧光定量PCR法；乙型肝炎病毒；准确性

中图分类号：R446.1        文献标识码：A

文章编号：1672-1721（2023）11-0098-03

DOI：10.19435/j.1672-1721.2023.11.033

乙型病毒性肝炎是临床常见传染性疾病，兼具感染率高、传播途径复杂、流行面广等特点[1]。主要因乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）所致，若长期携带HBV，容易导致肝脏炎性损伤，甚至诱发肝硬化、肝衰竭、肝细胞癌等疾病。相关报道指出[2]，目前我国乙肝患者数量居全世界首位，极大地威胁着国民健康，故需重视乙肝临床诊疗工作。近年来，随着分子生物技术、免疫学的飞速发展，可以通过聚合酶链式反应法（polymerase chain reaction，PCR）、酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）等检测HBV标志物。且有报道指出[3]，ELISA通过测验HBV表达蛋白的抗体、抗原，能够诊断乙肝；但是容易受到HBV翻译、转录功能减弱等的干扰，出现假阴性，导致漏诊，影响后续治疗及预后。而PCR作为新型检验技术，通过荧光标记处理HBV-DNA，亦能检验HBV- DNA的翻译及转录情况，有助于提高检验准确性。本文就荧光定量聚合酶链式反应法（fluorescence quantitative polymerase chain reaction，FQ-PCR）在HBV检测中的准确性展开分析，报道如下。

1    资料与方法

1.1    一般资料    选择2020年1月—2021年6月接诊的100例HBV携带者，其中男68例，女32例，年龄23～58岁，平均年龄（41.5±10.8）岁，体重49～77 kg，平均（62.5±4.5）kg。纳入标准：（1）在就诊中发现HBV；（2）检查依从性好；（3）知情同意，自愿参加。排除标准：（1）恶性肿瘤疾病者；（2）严重内科疾病者；（3）凝血功能障碍者；（4）资料不完善者；（5）沟通、认知、精神障碍者；（6）免疫系统疾病者。

1.2    方法    全部入组者均行FQ-PCR、ELISA检测。（1）FQ-PCR：取晨起3 mL肘静脉血，采集血液样本前均空腹8～10 h，将其置入真空惰性分离胶促凝管，离心处理（时间10 min，转速3 500 r/min），制备血浆标本，之后通过荧光定量分析仪（仪器厂家：杭州安誉科技有限公司；仪器型号：AGS4800型）+荧光定量PCR診断试剂盒（购自中山大学达安基因股份有限公司）检测HBV-DNA。（2）ELISA：取晨起3 mL肘静脉血，采集血液样本前均空腹8～10 h，之后将血液样本放置在4 ℃冰箱，时间2 h，再离心处理（时间10 min，转速3 500 r/min，离心半径10 cm），将上层血清置入无菌试管备测，检测乙肝标志物时采用全自动酶免仪（仪器厂家：深圳市爱康生物科技有限公司；仪器型号：Uranus AE150型）+ELISA试剂盒（北京万泰生物药业股份有限公司），包括乙肝表面抗体（HBsAb）、乙肝表面抗原（HBsAg）、乙肝e抗原（HBeAg）、乙肝e抗体（HBeAb）、乙肝核心抗体（HBcAb），于450 nm位置读取酶标仪吸光度值，得到诊断结果。

1.3    观察指标    记录乙肝血清学标志物（HBsAb、HBsAg、HBeAg、HBeAb、HBcAb）结果，再将其阳性结果划分成7种模式，其中模式1为“大三阳”（HBsAg、HBeAg、HBcAb），模式2为“小三阳”（HBsAg、HBeAb、HBcAb），其他模式分别是：模式3（HBsAg、 HBeAg）、模式4（HBsAb、HBeAb、HBcAb）、模式5（HBsAb、HBeAb）、模式6（HBsAb、HBcAb）、模式7（HBeAb、HBcAb）。FQ-PCR检测阳性标准为HBV-DNA>1.0×102 IU/mL，ELISA检测阳性标准为吸光度值>1[4]。

1.4    统计学方法    采用SPSS 23.0统计学软件分析数据，正态分布的计量资料以x±s表示，采用t检验和方差分析，计数资料以百分比表示，采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2    结果

100例HBV携带者中“大三阳（模式1）”共24例，HBV-DNA含量平均为（8.24±1.12）copy/mL，阳性率为95.83%（23/24），均显著高于其他6项模式（P<0.05）；100例HBV携带者中“小三阳（模式2）”共31例，HBV-DNA阳性率为83.87%（26/31），均显著高于3，4，5，6，7模式（P<0.05）；而其他模式在HBV-DNA阳性率及含量方面均无明显差异（P>0.05），见表1。

3    讨论

乙肝是传染率高、起病缓慢、传播途径广的病毒性肝炎疾病。相关报道指出[5]，当前我国HBV携带者高达9 300万人，且HBV感染呈现世界性流行。人类因含HBV血液、体液经破损黏膜、皮肤进入机体而感染，且传播途径包括血制品传播、母婴传播[6-7]。我国母婴传播概率较高，约40%～50%的HBV感染人群因母婴传播而罹患乙肝。90年代初我国将儿童普种乙肝疫苗作为控制乙肝流行的重要策略[8]，通过几十年的努力，当前属于乙肝中度流行国家。尽管如此，由于我国是人口大国，所以当前HBsAg携带者仍较多，使得乙肝成为重要的公共卫生问题之一。临床强调对乙肝进行早诊早治，以阻止病情恶化，降低病死率。但是由于临床广泛应用抗病毒药物，使得HBV变异株数量显著增加，明显提高了传统HBV血清学检测难度[9]，导致检测可重复性、准确性等均出现一定缺陷，尚需完善检测方法。

当前临床可以通过下列方法诊断HBV感染。（1）HBV基因产物：除通过免疫学方法测定HBsAg、HBeAg等，还可依据免疫组织化学技术（兼具敏感性高、功能与形态相结合、特异性好、定位准确等优势）、肝脏组织形态学变化等测定HBV基因产物，进而明确病毒性肝炎是否由HBV感染所致。（2）影像学：如核磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）、计算机X线断层扫描（computed tomography，CT）以及超声等检查脾脏、胆囊以及肝脏等，从而评估有无肝硬化病变、慢性乙肝发生及进展、占位性病变性质等。（3）病理学：通过肝脏穿刺活检能够更为准确、早期观察肝组织细微病变，评估HBV患者肝脏状况，从而判断预后情况、药物疗效等。（4）HBV共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）：HBV cccDNA被彻底清除后意味着慢性乙肝患者被治愈。当前HBV cccDNA技术进展迅猛，且以选择性FQ-PCR发展较快，其能用于评估肝细胞内HBV cccDNA水平，从而反映免疫功能对HBV的控制情况，从而指导停药时机。不过若想检测HBV cccDNA，尚需肝组织活检，具有一定的创伤性，患者接受度不高，且需进一步明确检测标准，故推广难度较大。

本次研究表明，FQ-PCR检测HBV有较好效果。ELISA是检测HBV的常用方法，通过检测血清中特异性抗原与抗体，能够评估有无HBV感染，加之灵敏度高、价格低廉、操作简单，所以得到临床推广。然而实践中发现该方法仅能反映HBV感染免疫应答状态，无法定量分析HBV感染程度以及含量等[10]，所以存在一定的局限性；同时检测结果也易受到标本保存、洗板情况、加样时有无溅出、血清分离、孵育方式等因素的影响；另外，ELISA需要使用特殊设备，加之难以评估病毒量及感染程度间关系、反应时间长，不适用于急诊初筛、门诊与无偿献血。

陈春妍[11]、谢玉娜[12]的研究均指出，FQ-PCR能够有效检测HBV。本次研究亦发现FQ-PCR检测准确率较高。FQ-PCR兼具DNA探针杂交、PCR技术的优势，通过实施闭管、荧光技术检测，能够直接探测PCR过程中荧光信号，进而定量、定性评估HBV感染程度，反映其传染性与复制状况，有助于医师准确评估病情。另外，HBsAg是区分急性乙肝与健康携带者的重要指标，而HBeAg是评估血清有无传染性的重要指标，若是受检者表现为大三阳，提示HBV-DNA复制率高且传染性强。本研究亦显示，相比大三阳（模式1），小三阳（模式2）的阳性率较低。主要是小三阳患者HBV复制弱、传染性低，不过仍有HBV-DNA复制，故仅凭血清学难以评定结果，尚需检测HBV-DNA，从而监测病情，以便及时对症处理。值得注意的是，FQ-PCR也有局限性，例如无法对病原体入侵后机体抗体如何应答作出反映，也无法测定病原体数量，所以暂时不能取代血清学标志物；不过其检测结果敏感度高、可靠性强，便于医师评估HBV感染状态以及病毒DNA复制情况，能够在早期诊断、评估乙肝传染性，监测治疗情况等方面提供参考依据，所以临床应用价值仍较高。

综上所述，与ELISA相比较，FQ-PCR更能定量反映HBV复制、感染状况，有助于早期确诊乙型病毒性肝炎，以及判断传染性质与监测病情，值得推广。

参考文献

[1]   WANG X，ZHOU M，YANG H，et al.Correlation Between Fluorescence Quantitative PCR Detection of HBV-DNA and Chemiluminescence Enzyme Immunoassay for Detection of Hepatitis B Five Tests[J].China Continuing Medical Education，2018，2（9）：112-114.

[2]    郝迎军.不同方法学检测乙型肝炎病毒DNA与血清标志物的关系[J].现代医用影像学，2018，27（6）：2163-2164.

[3]    王兴昌，孙丽琴，梁春辉，等.慢性乙型肝炎患者抗病毒疗效监测中高灵敏荧光定量PCR技术的应用[J].热带医学杂志，2021，21（8）：1039-1042.

[4]    刘丽.乙型肝炎病毒核酸免提取荧光定量PCR方法应用价值分析[J].中国医疗器械信息，2021，27（16）：60，137.

[5]    吴晓利.实时荧光定量PCR与PCR-ELISA在乙型肝炎病毒DNA定量检测中的应用比较[J].生物化工，2021，7（3）：97-98，101.

[6]    LIU J，WANG D，SONG C，et al.Clinical value of fluorescence quantitative PCR （FQ-PCR） in detection of hepatitis B virus DNA （HBV-DNA） and ELISA in detection of hepatitis B virus marker（HBV-M）[J].China Medicine and Pharmacy，2018，13（11）：65-66.

[7]   WANG K K，YANG K，ZHAO J，et al.Rapid Detection of Hepatitis B Virus Nucleic Acid Based on Microfluidic Chip Using Fluorescence Quantitative PCR[J].Journal of Analytical Science，2018，8（4）：35-37.

[8]    張会娟.荧光定量PCR法在乙型肝炎病毒检测中的应用价值[J].现代诊断与治疗，2021，32（8）：1296-1298.

[9]    赵春红.荧光定量PCR法与酶联免疫吸附法检测乙型肝炎病毒的效果比较[J].中国实用医刊，2020，47（18）：42-44.

[10]    李佳丹.PCR技术在乙型肝炎检验中的应用价值分析[J].中国现代药物应用，2019，13（20）：29-30.

[11]    陈春妍.荧光定量PCR法与酶联免疫吸附法在乙型肝炎病毒检测及疗效评价中的应用价值探究[J].中国现代药物应用，2019，13（14）：31-33.

[12]    谢玉娜.荧光定量聚合酶链式反应法与酶联免疫吸附试验法在乙型肝炎病毒检测中的应用价值[J].医疗装备，2019，32（10）：47-48.

（收稿日期：2023-01-22）