银杏叶对糖尿病睾丸损伤治疗作用的网络药理学分析*

史文静,余 薇,查文良,2**

(1.湖北科技学院医学部药学院,湖北 咸宁 437100;2.湖北科技学院附属第二医院)

糖尿病(diabetes mellitus,DM)是一种慢性高血糖代谢性疾病,长期的高血糖状态将导致各种组织的慢性损害和功能障碍[1],包括男性睾丸受损导致的生育问题和生殖功能障碍[2]。近年来DM发病率逐年上升,患病者并发症层出不穷,严重影响了男性生殖功能,导致人类生育能力逐渐下降[3]。据报道,90%的男性慢性DM患者患有性功能障碍和睾丸功能障碍[4],其中处于生育年龄的患者更为严重,这已经严重影响了患者的生活质量[5]。然而,目前还没有任何干预措施可以治疗DM引起的睾丸功能障碍。

银杏叶(ginkgo biloba,GB)是传统中草药之一,最初用于治疗呼吸和消化系统疾病,因被证实可提取出白果内酯、异兰花素、槲皮素、山柰酚等有益的化合物,而被逐步用于防治听力损伤、神经退行性疾病、白内障、肝肾损伤等疾病[6]。而且,现已有研究证明GB中的主要化合物萜烯内酯和黄酮糖苷具有抗DM、抗高血压和抗高脂血症的特性[7]。但是是否能用于治疗DM睾丸损伤以及具体机制尚未明确,因此,需要进一步筛选GB中的有效活性成分,阐明其改善DM睾丸损伤的具体作用通路及机制。网络药理学是一门近年兴起的学科,主要运用网络方法,分析药物与疾病之间的关系,研究“多成分、多靶点、多途径”的协同作用关系,其突破了传统的“一个基因一个药物一个疾病”理念,为研究传统中药和现代药理学之间的相互关系搭建了桥梁[8],有助于我们更精准更快速地预见防治疾病的关键所在。本研究通过网络药理学方法探索GB在生物体内的作用,有效揭示其化合物治疗DM睾丸损伤的潜在机制,为以后治疗DM导致的生殖功能损伤提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 GB活性成分来源和靶点获取

在TCMSP数据库[9](https://tcmspw.com/tcmsp.php)中获取GB化合物活性成分,并将其在PubChem平台[10]上(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)转为Canonical SMILES。进入小分子化合物靶点预测平台[11](http://www.swisstargetprediction.ch/),选择物种“Homo sapiens”并以Probability ≥ 0.1为标准获取靶点信息,通过UniProt平台[12](https://www.uniprot.org/)将蛋白靶点进行规范,去重,最后作为GB靶点集。整理数据,导入Cytoscape 3.9.1软件,构建GB活性成分-靶点网络图。

1.2 DM睾丸损伤靶点来源

以“Diabetic testicular injury”为搜索词,在Genecards数据库[13](https://www.genecards.org/)和OMIM数据库[14](https://omim.org/)中收集与DM睾丸损伤的相关靶点,整理去重,得到疾病靶点集。

1.3 获得GB与DM睾丸损伤交集靶点并构建网络图

将GB靶点集和疾病靶点集导入jvenn网站[15](http://jvenn.toulouse.inra.fr/app/example.html),获得GB对DM睾丸损伤的潜在靶点集。整理活性成分和靶点集数据,利用Cytoscape 3.9.1软件,构建GB活性成分靶点-疾病-交集靶点网络图。

1.4 蛋白-蛋白相互作用网络(PPI)构建与分析及获得核心靶点

将GB与疾病的交集靶点导入STRING数据库[16](https://string-db.org/)中,设置medium confidence(置信度)>0.400,得到的string_ tsv.数据文件和可视化PPI网络图。通过Cytoscape软件,利用CytoNCA插件评价交集靶点的Degree值,筛选出≥中位数的靶点构成Hub集;利用MCODE插件的聚类分析,筛选出各个功能模块所涉及的靶点基因集,构成MCODE集;再利用CytoHubba的MCC算法进行拓扑分析,排名前1/2的靶点基因构成MCC集。最后将Hub集、MCODE集和MCC集数据取交集,得到核心靶点集。

1.5 GO富集分析及可视化

通过David数据库(https://david.ncifcrf.gov/),选择OFFICIAL_GENE_SYMBOL和“Homo sapiens”,进行GO(gene ontology)功能富集分析,阐明与GB相互作用的靶蛋白在基因功能中的作用,并利用bioinformatics平台(http://www.bioinformatics.com.cn)对其结果进行可视化处理分析。

1.6 KEGG通路富集分析及构建相关通路网络图

通过Metascape 平台(https://metascape.org)[17],分析与GB相互作用的靶蛋白在信号通路中的作用,得到KEGG通路富集分析结果,进入bioinformatics平台对其进行可视化分析,利用Cytoscape构建GB活性成分-靶点-通路网络。

1.7 分子对接验证GB关键活性成分与核心靶点的结合作用

在GB前2个关键活性成分及其2个相关基因靶点之间进行分子对接。从PDB数据库(https://www.rcsb.org/)下载MAPK1、MAPK8的蛋白靶点PDB格式的3D结构,通过Pubchem数据库获取有效成分对苯二甲酸二(2-乙基己)酯{bis[(2S)-2-ethylhexyl]benzene-1,2-dicarboxylate}和十八碳二烯(Mandenol)的SDF结构,利用Chem 3D转换成PDB文件;随后运用AutoDock Tools 1.5.6软件对蛋白质靶点进行去水、加氢等操作,将活性成分及靶蛋白格式转换为pdbqt格式;最后通过AutoDock Vina进行分子对接,最终结果利用Pymol软件进行可视化,并用Discovery studio软件生成2D结合图。

2 结 果

2.1 GB有效活性成分及相关靶点

通过TCMSP数据库、SwissTargetPrediction平台,去重后获得362个预测靶点,Cytoscape 3.9.1软件进行GB活性成分-靶点可视化处理,见图1。

2.2 DM睾丸损伤基因靶点收集

分别在Genecards(Relevance Score≧10)和OMIM数据库中获得551和369个靶点,去重合并,最后得到873个DM睾丸损伤靶点。

2.3 交集靶点和韦恩图

通过jvenn网站获取韦恩图,其中交集靶点占7.2%,具体见图2。反向搜索交集靶点对应的活性成分,Cytoscape构建“GB活性成分-DM睾丸损伤-靶点”网络图,见图3,该网络包含97个节点,178条。

图2 DM睾丸损伤与GB靶点韦恩图

图3 GB活性成分-DM睾丸损伤靶点图

2.4 PPI网络构建及其核心靶点

为了探索GB对DM睾丸损伤治疗作用机制,我们将83个交集靶点导入STRING数据库中,去掉没有连线的靶点TACR3,得到可视化PPI网络图,该网络含82个节点,784条边,细节如图4所示,该图显示了这些基因间的复杂关系。再利用Cytoscape对结果进一步分析,采用CytoNCA计算Degree值,取前41个靶点作为Hub集,具体见图5。根据CytoHubba插件的MCC算法选取前1/2的靶点构成MCC集,具体见图6。使用MCODE进行聚类分析以生成高度连接的子网络,并将目标分配给4个组,构成MCODE集,网络构造如图7所示,再对评分最高的蛋白模块进行分析,得到15个核心目标节点。

图4 PPI网络图

图5 基于Degree值的PPI网络图

图6 MCC集的PPI网络图

图7 基于MCODE值的PPI网络图

将以上3种方法筛选出的核心靶点取交集,见图8,排名前20的靶点为:AKT1、SRC、PPARG、CASP3、EGFR、HIF1A、ESR1、CCND1、MAPK1、IGF1R、KDR、MAPK14、IL2、PTPRC、MAPK8、PIK3CA、AR、JAK2、NR3C1、KIT。

2.5 GO富集分析及可视化

为了进一步探讨GB参与DM睾丸损伤治疗的各种机制,我们在David数据库中对83个靶点进行了GO功能富集分析,共鉴定了三类项目:3617个生物过程(biologicalprocess,BP)、249个细胞组分(cellular component,CC)和415个分子功能(molecular function,MF),前15个的GO富集分析结果以直方图形式显示,其中生物过程条目3616个,细胞组成249个,分子功能415个,详见图9。结果表明3个最丰富的BP主要涉及正向调节蛋白质转运(positive regulation of protein transport)、蛋白质定位建立的正向调控(positive regulation of establishment of protein localization)和炎症反应的调节(regulation of inflammatory response)。高度富集的CC有膜筏(membrane raft)、微膜区(membrane microdomain)、膜区(membrane region)。此外,MF包括磷酸酶结合(phosphatase binding)、DNA结合转录因子结合(DNA-binding transcription factor binding)和类固醇结合(steroid binding)。另外,为了进一步探究具体靶点分别与BP、MF、CC的关系,我们制作了靶点-通路富集分析琴弦图,详见图10,节点大小与富集程度呈正相关。

图10 BP、CC、MF靶点-通路富集分析琴弦图

2.6 KEGG富集分析

83个交集靶点通过KEGG途径富集分析进行评估,得到253条KEGG通路,根据富集程度及基因比率纳入前20条通路,如图11所示。其中主要的代谢通路是MAPK代谢通路(MAPK signaling pathway)、PI3K-Akt信号通路(PI3K-Akt signaling pathway);重要靶点为MAPK1、MAPK14、MAPK8、AKT1、PIK3R1。

图11 KEGG通路富集分析桑基-气泡图

2.7 GB活性成分-靶点-通路网络图

将核心靶点整理、去重、反向查找GB活性成分,筛选出前10个有效活性成分,其程度值均>5,再用Cytoscape进行结果可视化分析,详见图12。基于拓扑属性分析,我们选择度值(degree)、接近中心性(closeness centrality)和介数中心性(betweenness centrality)作为化合物与靶点的筛选标准,确定了对苯二甲酸二(2-乙基己)酯{bis[(2S)-2-ethylhexyl]benzene-1,2-dicarboxylate}和十八碳二烯(Mandenol)是GB治疗DM睾丸损伤的关键活性成分,见表1。

表1 GB活性成分-潜在靶点网络图的拓扑参数

图12 GB活性成分-靶点-通路网络图

2.8 分子对接结果

如图13,根据PPI互作网络和KEGG富集分析的靶点结果,对其中两个互作关键靶点做了分子对接验证,我们得到以下结果:化合物和靶点蛋白存在较好的结合作用。第一对结合能为-6.9kcal/mol,小于-5kcal/mol,认为该对接结合能力较强,从氢键作用来看,化合物与该靶点的利用Pymol软件未显示氢键,具体作用力详见图13A-C,各种颜色代表的作用力见图例。第二对结合能为-4.3kcal/mol,认为该对接结合能力中等,从氢键作用来看,化合物与该靶点的TYR-205和ARG-172氨基酸残基生成长度为3.0、3.3Å的氢键,具体作用力详见图13D-F。

图13 核心成分-关键靶点的分子对接图

3 讨 论

目前DM引起的睾丸损伤已经严重影响到人类的生殖功能障碍,如何预防和治疗DM睾丸损伤疾病迫在眉睫。已有研究表明硝酸钠[18]、拉帕霉素[19]等西药成分可以减轻DM睾丸损伤,中药能否改善该疾病的损伤还须待研究和证明。本文从网络药理学角度出发,经过TCMSP数据库、Genecards数据库等多个平台搜集筛选靶点数据,整理去重,利用bioinformatics平台、Cytoscape 等工具分析探索其间的关系,使用度值、介数中心性和接近中心性评价挑选出GB治疗DM睾丸损伤的关键靶点、活性成分和有效通路,并利用分子对接对其重要活性成分和相关靶点进行验证。

通过网络药理学研究,我们发现GB中具有27种活性化合物能治疗DM睾丸损伤,其中对苯二甲酸二(2-乙基己)酯、十八碳二烯、异甘草醇的度值、介数中心性和接近中心性较高,故推测其可能是GB治疗DM睾丸损伤的主要作用成分。而MAPK1、MAPK14、MAPK8等靶点在疾病的发生、发展过程中发挥着重要作用。有研究发现,脂肪间充质基质细胞源性外切体(ADSC-Exos)可以通过激活PI3K/AKT和MAPK/ERK1/2信号通路来抑制其凋亡,进而促进精子细胞的增殖和迁移[20]。除此以外,Lin等[21]还发现贝杜林酸(betulinic acid,BA)可以通过p38/ERK MAPK抑制和Nrf2介导的抗氧化防御激活,来保护玉米烯酮(zearalenone,ZEA)诱导的睾丸损伤。这都是药物通过MAPK保护睾丸免受睾丸损伤的可靠依据。

我们初步探索了GB治疗DM睾丸损伤,可能是通过作用于MAPK1、MAPK8等靶点调控参与MAPK、AKT、AGE-RAGE等信号通路,在这之中,我们分别对MAPK1和MAPK8与对苯二甲酸二(2-乙基己)酯、十八碳二烯进行验证。证明了GB发挥主要功能的活性成分是对苯二甲酸二(2-乙基己)酯、十八碳二烯,并通过MAPK对DM睾丸损伤疾病进行细胞增殖生长和抗损伤保护作用,进而改善男性DM患者的生殖功能。这为传统中药GB防治DM睾丸损伤的作用机制提供了有力理论支撑。但本研究仅仅局限于数据的挖掘、靶点的预测和分子对接验证,尚没有可靠的在体实验进行佐证,故而需要进一步的探索。