川芎嗪通过miR-34a对氧化型低密度脂蛋白诱导的冠状动脉内皮细胞损伤的保护作用

顾民华,顾 勇

(海南省中医院心血管科,海南 海口 570203)

冠状动脉粥样硬化性心脏病是冠状动脉血管发生动脉粥样硬化病变而引起血管腔狭窄或阻塞,造成心肌缺血、缺氧或坏死而导致的心脏病,起病急骤且病死率极高,冠心病早期诊断及治疗对改善其预后具有重要价值[1-2]。冠心病根据临床表现分为稳定性冠心病和急性冠状动脉综合征,诊疗不及时往往导致患者发展成慢性心力衰竭而影响生存质量[3-4]。微小RNA(miRNA)为长度22 bp左右的非编码小分子RNA,在基因转录后通过翻译抑制或降解/裂解mRNA调控基因的表达。越来越多的研究证实miRNA参与了心血管疾病的发生、发展及转归,在冠心病发病机制、病情及预后评估中具有重要价值[5-6]。川芎嗪有抑制心肌收缩的作用,并使心率减慢,增加心脏灌流量及降低全血黏度,缓解主动脉痉挛性收缩,对心肌具保护作用,但其具体分子机制尚未明确[7-8]。本实验旨在探讨川芎嗪通过miR-34a对氧化型低密度脂蛋白(Oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL)诱导的人冠状动脉内皮细胞(Human coronary artery endothelial cells,HCAECs)损伤的保护作用及机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料 川芎嗪(纯度98.5%)(中国药品与生物制品检定所);HCAECs(上海钰博生物科技有限公司);ox-LDL(中国医学科学院基础研究所);DMEM培养基、FBS(北京Solarbio);丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)试剂盒(南京建成生物工程研究所);Trizol试剂(大连宝生物公司);肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素1β(Interleukin-1β,IL-1β) ELISA试剂盒(上海酶联生物技术有限公司),实时荧光定量PCR相关试剂盒(北京天根公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养:HCAECs用含有10%FBS的DMEM培养基,于37 ℃、5% CO2培养箱常规培养。

1.2.2 实验分组:Con组(正常培养人HCAECs),ox-LDL组(用50 mg/L的ox-LDL干预HCAECs),1、10、100 mmol/L组(HCAECs用1、10、100 mmol/L川芎嗪处理+ox-LDL干预),ox-LDL+anti-miR-NC组、ox-LDL+anti-miR-34a组、ox-LDL+miR-NC组、ox-LDL+miR-34a组(ox-LDL干预HCAECs分别转染anti-miR-NC、anti-miR-34a、miR-NC、miR-34a模拟物),ox-LDL+miR-NC+100 mmol/L组、ox-LDL+miR-34a+100 mmol/L组(将miR-NC、miR-34a模拟物分别转染至ox-LDL干预HCAECs+100 mmol/L川芎嗪)。

1.2.3 MDA及SOD检测:收集上述各组细胞上清液,采用酶联免疫吸附法检测MDA及SOD,严格按照操作试剂盒说明书检测。

1.2.4 miR-34a表达检测:采用实时荧光定量PCR法(qRT-PCR)检测miR-34a表达。采用Trizol试剂从HCAECs中提取总RNA后,微量核酸仪检测RNA的纯度和浓度。cDNA合成通过逆转录试剂盒进行,引物序列为上游引物5’-CTTGAACTCCTGGGGCCTGAAG-3’,下游引物为5’-GCCAAAGAAACACTCACAGCT-3’。按照95 ℃ 3 min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s(35个循环)的程序进行PCR扩增。选择U6为内参,参照2-ΔΔCt法计算miR-34a相对表达量。

1.2.5 试剂盒检测细胞炎症反应指标:提取HCAECs的上清液,采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测TNF-α及IL-1β,严格按照操作试剂盒说明书检测。

2 结 果

2.1 川芎嗪对ox-LDL干预的HCAECs氧化应激和炎症反应的影响 见表1。与Con组比较,ox-LDL组HCAECs的MDA含量、TNF-α、IL-1β水平升高,SOD活力降低,差异有统计学意义(P<0.05);与ox-LDL组比较,1、10、100 mmol/L组细胞MDA含量及TNF-α、IL-1β水平降低,SOD活力升高,差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 川芎嗪对ox-LDL干预的HCAECs氧化应激和炎症反应的影响

2.2 川芎嗪对ox-LDL干预的HCAECs中miR-34a的影响 见表2。与Con组比较,ox-LDL组细胞miR-34a表达水平升高,差异有统计学意义(P<0.05);与ox-LDL组比较,1、10、100 mmol/L组细胞miR-34a表达水平降低,差异有统计学意义(P<0.05)。

表2 川芎嗪对ox-LDL干预的HCAECs中miR-34a的影响

2.3 抑制miR-34a表达对ox-LDL干预HCAECs氧化应激和炎症反应的影响 见表3。与ox-LDL+anti-miR-NC组比较,ox-LDL+anti-miR-34a组细胞MDA含量以及TNF-α、IL-1β水平降低,SOD活力升高,差异有统计学意义(P<0.05)。

表3 抑制miR-34a表达对ox-LDL干预HCAECs氧化应激和炎症反应的影响

2.4 过表达miR-34a对ox-LDL干预HCAECs氧化应激和炎症反应的影响 见表4。与ox-LDL+miR-NC组比较,ox-LDL+miR-34a组细胞MDA含量以及TNF-α、IL-1β水平升高,SOD活力降低,差异有统计学意义(P<0.05)。

表4 过表达miR-34a对ox-LDL干预HCAECs氧化应激和炎症反应的影响

2.5 过表达miR-34a表达逆转川芎嗪对ox-LDL干预HCAECs氧化应激和炎症反应的影响 见表5。与ox-LDL+miR-NC+100 mmol/L组比较,ox-LDL+miR-34a+100 mmol/L组细胞MDA含量以及TNF-α、IL-1β水平升高,SOD活力降低,差异有统计学意义(P<0.05)。

表5 过表达miR-34a表达逆转川芎嗪对ox-LDL干预HCAECs氧化应激和炎症反应的影响

3 讨 论

ox-LDL由低密度脂蛋白在氧化反应下产生,参与机体多种生理过程,在体外的主要用途已被用于建立动脉粥样硬化模型,但大量证据表明即使在低浓度下也能成功诱导动脉粥样硬化前的HCAECs功能障碍、死亡和病理性新血管形成,血清ox-LDL被鉴定为人类早期冠心病的危险因素[9-10]。ox-LDL可通过损伤血管内皮细胞、形成泡沫细胞、诱导免疫复合物产生免疫损伤等多种机制参与冠心病发病机制[11]。目前发现多种药物可通过ox-LDL参与冠心病发病机制,ox-LDL可作为药物及信号通路靶点[12]。冠心病是临床最常见的心血管疾病,现代药理研究将冠心病心绞痛分为虚实证,其中益气活血通络、益气养阴、温阳通络等方法是治疗虚证的主要手段;疏肝理气化瘀、活血化瘀、祛痰化瘀等是治疗实证的主要手段。川芎嗪是中药川芎的有效成分之一,具有活血通络等功效,可抗血小板聚集扩张小动脉,改善微循环以及活血化瘀,对冠心病及血管炎也有很好的治疗作用[13]。刘英等[14]研究发现川芎嗪可减轻冠心病大鼠炎症反应和氧化应激反应,在一定程度上改善心肌损伤,可能与激活AMPK/Nrf-2/HO-1信号通路有关。李一[15]研究表明,丹参川芎嗪注射液可减少冠心病发作的次数,缩短心绞痛持续的时间,提高其临床疗效,且用药的安全性较高。李敏等[16]研究表明,丹参川芎嗪注射液对冠状动脉粥样硬化具有较好的效果。王国峰等[17]研究表明,川芎嗪降低ox-LDL诱导内皮细胞炎症反应。阚科佳等[18]研究表明,舒洛地特对ox-LDL诱导人脐静脉内皮细胞损伤的具有一定程度的保护作用。本实验发现,ox-LDL干预增加HCAECs的MDA、TNF-α、IL-1β水平,但降低SOD活力;而川芎嗪可以拮抗ox-LDL干预的HCAECs的MDA、TNF-α、IL-1β水平增加和SOD活力降低。

miRNA为长度22 bp左右的非编码小分子RNA,在基因转录后通过翻译抑制或降解/裂解mRNA调控基因的表达。研究发现miR-34a与心脏病存在关联,miR-34a参与心脏病发病机制[19]。黄仲略等[20]研究发现高糖刺激可促使H9c2心肌细胞凋亡,整个过程与miR-34a的高表达密切相关,可在临床为糖尿病心肌病的预防与治疗上提供新的思路。范丽等[21]发现miR-34a可抑制缺氧复氧损伤的人H9C2心肌细胞凋亡,其机制可能与促进PI3K磷酸化,活化PI3K/Akt信号通路,抑制细胞凋亡蛋白表达有关。基于目前的研究发现,推测miR-34a参与心脏相关疾病机制包括抑制心肌细胞凋亡、氧化应激及促进心肌细胞修复等。本实验数据显示,HCAECs中miR-34a表达水平在ox-LDL干预后增加,但在川芎嗪给药后显著降低。与ox-LDL+anti-miR-NC组比较,ox-LDL+anti-miR-34a组细胞MDA含量以及TNF-α、IL-1β水平显著降低,SOD活力显著升高。验证 ox-LDL干预后,HCAECs 中miR-34a 表达与正常对照组比较,水平显著升高;给予miR-34a 抑制剂后,细胞凋亡显著降低[22]。miR-34a通过靶向SIRT1蛋白调控氧化型低密度脂蛋白介导的HCAECs凋亡。已经有研究报道,葡萄籽原花青素通过下调miR-34a减轻过氧化氢诱导的心肌细胞损伤。本实验研究显示,过表达miR-34a表达逆转川芎嗪对ox-LDL干预HCAECs氧化应激和炎症反应的影响。说明川芎嗪通过下调miR-34a减轻ox-LDL干预HCAECs损伤。

综上所述,川芎嗪通过抑制miR-34a降低ox-LDL诱导的人HCAECs炎症反应和氧化应激,川芎嗪可能为潜在的冠心病治疗药物。