婴幼儿食品中克罗诺杆菌属的分离鉴定及耐药性分析

◎ 翟平平，占忠旭，范宏伟，章 洁，刘中华，朱应飞

（1.江西省检验检测认证总院食品检验检测研究院，江西 南昌 330000；2.武汉轻工大学 生命科学与技术学院，湖北 武汉 430023）

克罗诺杆菌属（Cronobacterspp.）由革兰氏阴性食源性病原体组成，广泛存在于婴幼儿奶粉、米粉以及肉类、饮用水、蔬菜中，婴幼儿是该菌感染的高危人群，致死率最高可达80%[1]。2017 年报道了某医院检出因克罗诺杆菌感染导致婴幼儿腹泻的病例[2]，2018 年广东省广州市妇女儿童医疗中心报道3 例新生儿因克罗诺杆菌感染导致化脓性脑膜炎的病例[3]，2022 年知名品牌雅培奶粉曝出因克罗诺杆菌污染导致3 名婴幼儿感染的病例[4]。虽然大多数克罗诺杆菌分离株对常用抗菌剂敏感，但食品样品中的一些分离株已报告有耐药性[5]。在农业中不适当和不合理使用抗菌剂增加了菌株的耐药性，特别是多重耐药[6]，这已成为一个公共卫生问题，耐药菌的出现可能导致常规抗生素治疗失败，从而造成更大的死亡风险。

为了解婴幼儿食品中克罗诺杆菌属的耐药状况，本实验室对婴幼儿食品样品中克罗诺杆菌属进行分离鉴定，并测定其耐药性，为应对婴幼儿克罗诺杆菌属感染疾病的发生提供有效的治疗参考。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

实验材料：婴幼儿米粉。

实验试剂：缓冲蛋白胨水（Buffer Peptone Water，BPW）、改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤万古霉素（Modified Lauryl Sulfate Tryptose Vancomycin Medium，mLST-Vm）、阪崎肠杆菌显色培养基、胰蛋白胨大豆琼脂（Trypticase Soy Aga，TSA）、阪崎肠杆菌生化鉴定试剂盒（北京陆桥）。多黏菌素B、万古霉素、环丙沙星、呋喃妥因、氨苄西林、头孢曲松、氯霉素、头孢噻肟，上海源叶；MH 肉汤培养基（Mueller-Hinton Broth）、磷酸缓冲盐溶液（Phosphate Buffer Saline，PBS），北京国药。

实验仪器：电子比浊计，法国生物梅里埃公司；恒温培养箱，上海智城分析仪器制造有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 增菌培养

无菌条件下准确称取100 g待检婴幼儿米粉样品，加到900 mL 缓冲蛋白胨水（BPW）中，放入36 ℃生化培养箱培养18 h，进行前增菌，取1 mL 上述前增菌液，接种到mLST-Vm 管中，放入44 ℃生化培养箱，培养24 h。

1.2.2 平板分离

无菌条件下取1 环mLST-Vm 增菌液，接种阪崎肠杆菌显色平板，放入36 ℃生化培养箱，培养24 h，观察结果，挑取可疑菌落接种TSA 琼脂平板，25 ℃培养48 h[7]。

1.2.3 生化鉴定

挑取纯化后的可疑单菌落，制作0.5 个麦氏浊度菌悬液，按照阪崎肠杆菌生化鉴定试剂盒操作说明进行鉴定，将菌悬液滴加到相应的生化反应孔，置于36 ℃培养箱培养24 h，观察结果。

1.2.4 药物敏感性试验

药敏试验依据美国临床与实验室标准化协会（CLSI2022 版）标准规定进行操作，所用抗生素包括氯霉素（苯丙醇类），呋喃妥因（硝基呋喃类），氨苄西林（青霉素类），多黏菌素B（多肽类），环丙沙星（氟喹诺酮类），头孢噻肟、头孢曲松（头孢类）[8]。

2 结果与分析

2.1 平板分离

阪崎肠杆菌显色平板上长出蓝绿色、边缘光滑、形态较小的典型菌落，TSA 琼脂平板上菌落颜色呈现黄色。平板结果见图1。

图1 平板分离菌落形态图

2.2 生化鉴定

挑取阪崎肠杆菌显色平板上的典型菌落，接种TSA 琼脂平板，进行阪崎肠杆菌生化试剂盒鉴定。检验结果为产生黄色素，氧化酶实验阴性，L-赖氨酸脱羧酶阴性，L-鸟氨酸脱羧酶阳性，L-精氨酸双水解酶阳性，柠檬酸水解阳性，D-山梨醇阳性，L-鼠李糖阳性，D-蜜二糖阳性，苦杏仁苷阴性。根据《食品安全国家标准 食品微生物学检验 克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）检验》（GB 4789.40 2016）标准规定，结果判定为阳性。结果见图2。

图2 克罗诺杆菌属生化鉴定结果图

2.3 耐药性分析

药敏试验结果显示，43 株阪崎克罗诺杆菌对氯霉素的耐药率为51.16%，对氨苄西林和呋喃妥因的耐药率均为4.65%，对头孢曲松和头孢噻肟的耐药率均为2.33%，对环丙沙星及多黏菌素B 均敏感。结果见表1。本研究中用到的抗生素MIC 折点及ATCC25922 质控范围见表2。

表1 43 株克罗诺杆菌耐药结果表

表2 抗生素判定标准表

3 结论与讨论

克罗诺杆菌属感染发病率较低，但会导致较高的死亡率，国内外特别重视婴幼儿食品中克罗诺杆菌属的污染。FAO/WHO 把阪崎肠杆菌列为婴儿配方奶粉中的A 类致病菌[9]。

本项目药敏试验结果显示，43 株克罗诺杆菌分离菌株中有22 株耐药，耐药率为51.16%，早期报道克罗诺杆菌对各种抗生素敏感，但自1987 年以来，有关该菌耐药性的报道不断增加[10]。本研究43 株克罗诺杆菌对氯霉素的耐药率为51.16%，对氨苄西林和呋喃妥因的耐药率均为4.65%，对头孢噻肟和头孢曲松的耐药率均为2.33%。氯霉素类抗生素抗菌谱广，吸收快，体内分布广泛，因而使用广泛，但其耐药性也倍受重视。

婴幼儿食用婴幼儿食品存在克罗诺杆菌属感染的潜在风险，克罗诺杆菌属的耐药性要引起重视。相关监管部门、生产企业需对婴幼儿食品生产、运输等各个环节卫生进行严格监管，防止婴幼儿食品受到致病性细菌的污染；临床上一旦发现感染克罗诺杆菌属的病例，应分析其药敏性，规范治疗，避免抗生素的滥用，防止出现超级耐药菌株。