乳鸽副黏病毒（PPMV-1）与大肠杆菌混合感染的诊断与防治

李婷婷 陆冰洋 丁树荣 唐娟 王彩先 刘华栋

关键词：鸽源Ⅰ型副黏病毒（PPMV-1）；RT-PCR；大肠杆菌；药敏试验；抗体效价

鸽副黏病毒病是由鸽源Ⅰ型副黏病毒（PigeonParamyxovirusType1，PPMV-1）引起的一种鸽急性、高度接触性传染病，又称鸽新城疫。PPMV-1病毒是经典新城疫病毒（Newcastlediseasevirus，NDV）的变异株，最早在20世纪70年代中东地区被发现，随后该病毒在世界范围内流行[1]。PPMV-1可经呼吸道和消化道传播，对不同日龄和品种的鸽均有易感性；该病毒对成年鸽损伤较轻，多表现为无症状感染，但对乳鸽或幼龄鸽危害较大[2]，感染后表现为扭颈、斜翅等神经症状，死亡率可达50%～80%[3-4]。随国内市场对鸽肉需求量的逐渐增大，肉鸽养殖规模不断扩大，鸽群感染PPMV-1的报道屡见不鲜[5-6]，该病对鸽群危害巨大，需进行重点防控。

鸽副黏病毒病与鸡新城疫症状相似，若对饲养环境不进行控制，通常伴有其他细菌感染[7-8]。李杰峰等[9]调查显示，新城疫病毒发生混合感染远高于其他病毒，在新城疫病毒的混合感染中，以大肠杆菌最为常见。大肠杆菌是动物体内一种条件性致病菌，大肠杆菌和鸽副黏病毒是引发鸽场疫情的“最佳搭档”，混合感染使鸽群发病率和死亡率均升高，造成严重的经济损失。2022年5月，太原市郊区某肉鸽场疑似发生鸽新城疫，表现为13～15d乳鸽精神沉郁、食欲减退、拉绿色稀便、斜颈等症状，每日死亡乳鸽10只左右；剖检可见病鸽腺胃乳头间和肠道弥漫性出血，黏膜变薄，盲肠扁桃体出血，脾脏、肾脏肿大，气管充血，肝脏表面有少量的白色纤维素性沉淀物，但成年鸽无明显临床症状。

本研究通过临床诊断，采集病鸽组织病料进行病毒PCR鉴定、病毒和细菌的分离培养、细菌生化鉴定、药敏试验等实验室诊断，以确诊其是否为鸽副黏病毒继发大肠杆菌的混合感染，并通过血清抗体检测及动物回归试验分析发病原因，制定综合防治措施。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验动物 15d未免疫健康乳鸽购自山西谷鸽儿鸽业有限公司；SPF鸡胚购自山东省农业科学院家禽研究所SPF试验场，14dSPF雏鸡由SPF鸡胚孵化。试验动物饲养于山西农业大学动物医学学院预防兽医医学研究室动物房内。

1.1.2 病料 2022年5月，采集太原郊区某肉鸽场发病乳鸽咽肛拭子，将拭子分别在病鸽的喉头和泄殖腔内旋转擦拭后取出，折断拭子头留于采样管中。针对病死乳鸽，剖检后无菌采集脑、肺、肝、脾等组织并做好标记，-20℃保存备用。随机选取发病鸽群的20只乳鸽和10对亲本成年鸽，翼下静脉采血2mL/只，于2000r/min离心5min，分离血清，4℃保存备用。

1.1.3 主要仪器与试剂 一次性采样器，购自汉威生物科技有限公司；RNA核酸提取试剂盒、新城疫病毒通用型RT-PCR检测试剂盒，购自哈尔滨元亨生物药业有限公司。营养琼脂培养基、营养肉汤培养基、伊红美蓝琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、三糖铁琼脂培养基、革兰氏染液和全部生化试剂，购自杭州滨和微生物试剂公司；抗菌药敏纸片，购自杭州微生物试剂公司；新城疫血凝抑制试验抗原，购自青岛易邦生物工程有限公司。

将三糖铁琼脂倒入试管制成斜面，其余琼脂均制成平板。1%鸡红细胞悬液、新城疫陽性和阴性抗原由山西农业大学动物医学学院预防兽医学研究室制备。

1.2 试验方法

1.2.1 鸽源Ⅰ型副黏病毒（PPMV-1）RT-PCR鉴定 拭子样本经涡旋振荡后吸取100μL备用。称取病死鸽肺脏和脾脏组织各1g，剪碎后取0.05g混合物加入1.5mL无菌生理盐水研磨，匀浆后8000r/min离心2min，吸取100μL上清备用。

按照柱式RNA核酸提取试剂盒和新城疫病毒通用型RT-PCR检测试剂盒使用说明书提取PPMV-1的RNA，并进行RT-PCR扩增和电泳检测。

1.2.2 病毒的分离培养 取病死鸽病料组织，研磨匀浆后反复冻融3次，加入终浓度为4000IU/mL的青-链霉素双抗，室温下静置感作2h。10000r/min离心15min后吸取上清，经0.22μm的一次性细菌过滤器过滤后，按照0.2mL/枚的剂量，接种于5枚10d的SPF鸡胚尿囊腔中，在温度37℃、湿度60%的孵化箱中孵育，每8h照蛋一次，弃去24h内疑似细菌感染的死亡鸡胚，收集24～96h内死亡鸡胚及其尿囊液，观察死亡鸡胚的病理变化，并连传3代。

将收获的尿囊液，并按照《新城疫诊断技术》（GB/T16550—2008）方法[10]进行血凝试验（HA）。将HA检测阳性的尿囊液用NDV（新城疫病毒）和H5和H9亚型AIV（禽流感病毒）标准阳性血清进行血凝抑制试验（HI），将阳性病毒尿囊液保存于-70℃。

1.2.3 细菌的分离培养 在无菌条件下挑取病死鸽的心血、肝脏和脾脏组织液于营养琼脂平板上划线，37℃恒温条件下培养18～24h。挑取单个菌落，分别划线接种于麦康凯琼脂、伊红美蓝琼脂，穿刺接种于三糖铁斜面并涂布表面，37℃再培养24h，观察各菌落生长情况，挑取分离单个菌落涂片，革兰氏染色后镜检。

1.2.4 细菌的生化鉴定 挑取麦康凯琼脂培养基的单个菌落接种于营养肉汤中，37℃培养24h，待肉汤浑浊后用于常规生化试验。

1.2.5 药敏试验 采用K-B试纸扩散法[11]，选取18种临床常用药物，以标准质控菌株ATCC25922为参照，将大肠杆菌菌液均匀涂布在营养琼脂平板上，再将药敏纸片等距离（间隔≥24mm）贴于营养琼脂表面，37℃培养24h，测定各药敏纸片抑菌直径，依照《纸片法抗菌药物敏感试验标准》[12]判定结果。

1.2.6 乳鸽及成年鸽的抗体效价检测 分别取乳鸽和成年鸽的血清样本各20份，按照《新城疫诊断技术》[10]规定方法进行血凝抑制试验（HI），检测鸽群新城疫抗体效价。

1.2.7 动物回归试验 将第3代鸡胚尿囊液作为PPMV-1攻毒毒株，将大肠杆菌营养肉汤培养液（大肠杆菌含量调整为1.2×109cfu/mL）作为大肠杆菌攻毒菌株，分别感染15d非免疫健康乳鸽和14dSPF雏鸡，感染分组和感染剂量列于表1。

病毒尿囊液采用滴鼻点眼的方式感染A组乳鸽和E组雏鸡，大肠杆菌菌液采用肌肉注射的方式感染B组乳鸽和F组雏鸡，C组乳鸽和G组雏鸡同时接入病毒尿囊液和大肠杆菌菌液，对照D组乳鸽和对照H组雏鸡给予同等剂量的生理盐水，每组5只；隔离饲养14d，观察记录各组动物发病情况，临床症状和死亡情况，分离发病和病死动物体内的病毒和细菌并进行检测。

2 结果与分析

2.1 鸽源Ⅰ型副黏病毒的RT-PCR鉴定

由图1可知，被检组织样本与新城疫病毒试剂盒阳性对照均在362bp处扩增出特异性条带，表明该鸽场病鸽呈PPMV-1阳性。

2.2 病毒分离和培养

病鸽组织病料连传3代后，第3代尿囊液的凝集效价为2log2～5log2。HI结果显示，尿囊液中毒株的凝集反应可以被NDV阳性血清抑制，但不能被AIV阳性血清抑制。剖检96h内死亡鸡胚可见全身呈弥漫性出血和水肿，尤其以鸡胚头部、眼周及翼下出血最为严重；96h未死亡鸡胚头部有点状出血点，剖检可见肠道出血。

2.3 细菌的分离鉴定

2.3.1 细菌的分离培养 从图2可以看出，在普通营养琼脂上可见灰白色菌落，呈圆形半透明状；麦康凯琼脂上可见红色圆形菌落；伊红美蓝琼脂上可见带有黑色金属光泽菌落；三糖铁斜面的表面和内部均呈现黄色，并有产气现象。

2.3.2 细菌的染色 革兰氏染色后，显微镜下可见大量红色、两端钝圆的短小杆菌，散在或成对分布，为革兰氏阴性菌，结果如图3所示。

2.4 生化鉴定

分离菌生化鉴定结果如表2所示，结果表明该菌为大肠杆菌。

2.5 药敏试验

由表3可知，该菌对丁胺卡那霉素、庆大霉素和安普霉素高敏；对头孢噻肟和链霉素中敏；对培氟沙星和土霉素低敏，对其余药物均表现为耐药，说明分离株存在多重耐药现象。

2.6 新城疫抗体效价分布

从表4可以看出，在所检测的乳鸽和成年鸽的血清样本中，乳鸽的新城疫抗体效价均低于5log2，其中，14只种鸽的新城疫抗体效价在5log2以上，合格率为70%，且离散度较大。

2.7 动物回归试验结果

从表5可以看出，3组乳鸽在攻毒后均出现精神沉郁、采食量下降、闭眼缩脖等症状。其中，A、C组乳鸽出现扭头斜颈、拉黄绿色稀便症状，剖检可见腺胃乳头有出血点，腺胃和肌胃交界处出血，肠道及盲肠扁桃体出血，肾脏有出血点，脑组织出血、水肿；B组乳鸽，F和G组雏鸡均有呼吸道症状，表现为呼吸困难、下痢、粪便呈水样；B、C、F、G组乳鸽剖检后均可见肠道及盲肠扁桃体出血，心脏、肝脏表面有白色纤维素样沉淀；E组雏鸡仅有1只发病，剖检可见肠道出血，未见其他病变，其余雏鸡无临床癥状和肉眼可见病变。通过RT-PCR进一步检测发现，A、C组乳鸽均呈PPMV-1阳性，E、G组雏鸡PPMV-1阳性率分别为60%和40%。在B、C、F、G组中均可分离到大肠杆菌。D和H这2个对照组均无任何临床症状，PPMV-1和大肠杆菌检测结果均为阴性。

2.8 诊断与治疗

根据病鸽临床症状及病理剖检变化，结合实验室病毒和细菌鉴定结果，发病鸽群可诊断为鸽I型副黏病毒病与大肠杆菌病混合感染。在此基础上进一步制订防治方案，隔离病鸽，无害化处理病死鸽及其粪便和饲料。针对鸽场内乳鸽新城疫抗体效价不合格的情况，紧急使用2倍剂量的新城疫Ⅳ系疫苗滴鼻点眼。依据药敏试验结果，在饮水中加入丁胺卡那霉素治疗大肠杆菌感染，同时添加电解多维和黄芪多糖。鸽场实行封闭管理，全面清扫和消毒，待病情得到控制后，鸽群全部采用2倍剂量的新城疫Ⅳ系疫苗滴鼻点眼，补免一次，并定期检测抗体效价。

3 结论与讨论

鸽新城疫自20世纪80年代经香港传入广东、广西、山东等省，随着我国肉鸽养殖业和赛鸽业的快速发展，该病在我国各省均有流行发生，制约了我国养鸽业的健康发展。目前，接种新城疫疫苗是防控该病的主要手段，但在肉鸽生产养殖中，乳鸽在28日龄出栏上市，所以，仅对亲本种鸽和后备种鸽进行新城疫疫苗免疫，而乳鸽体内的新城疫抗体均来自于母源抗体。研究表明，种鸽的新城疫抗体滴度值与种蛋、各周龄乳鸽的母源抗体滴度值呈正相关[13]，种鸽体内保持较高的抗体水平是保证商品乳鸽不感染新城疫的必要条件[14]。本研究中，该鸽场15d乳鸽抗体效价均低于5log2，且亲本种鸽抗体合格率仅为70%。由此可见，若种鸽抗体效价参差不齐，则容易发生乳鸽感染新城疫的现象。

大肠杆菌是肉鸽生产养殖中常见的条件性致病菌[15]，极易在饲养环境不良、免疫力下降时侵害鸽群，对鸽群健康危害巨大。目前，治疗大肠杆菌感染主要依靠抗生素，但是由于抗生素的滥用，大肠杆菌的耐药性增强，耐药菌株不断增多[16]。本研究药敏试验结果表明，此次分离到的大肠杆菌存在多重耐药现象，对β内酰胺类、喹诺酮类、大环内酯类抗生素耐药或低敏，仅对氨基糖苷类抗生素部分药物高敏。王洪彬等[17]临床分离到的鸽源大肠杆菌存在严重的多重耐药性，对阿莫西林、多西环素、磺胺二甲氧嘧啶和林可霉素等多种抗生素耐药。CHROBAK-CHMIEL等[18]从赛鸽口腔中分离出的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌，经检测发现，大肠杆菌分离物对阿莫西林、庆大霉素、四环素、强力霉素、磺胺甲恶唑-甲氧苄啶和氨苄西林等均具有耐药性。可见，生产养殖中滥用抗生素导致的细菌耐药性增强和多重耐药现象严重影响了鸽大肠杆菌病的防治。

在BADR等[7]采集的50个鸽群组织样本中，有82%存在大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌间的双重或多重混合感染，有12%存在PPMV-1与细菌的混合感染。国内也多有报道鸽群PPMV-1与大肠杆菌、沙门氏菌的混合感染病例[19]，研究表明，鸽I型副黏病毒与细菌混合感染易造成鸽群发病率和死亡率升高[20]。因此，肉鸽生产养殖中更应重视大肠杆菌与副黏病毒的混合感染。

本研究分离到的PPMV-1和大肠杆菌分别感染乳鸽和雏鸡，可见PPMV-1分离株对乳鸽具有极强的致病性，发病率为100%，死亡率可达80%～100%；而攻毒组雏鸡并结合RT-PCR检测后发现，雏鸡感染PPMV-1后存在带毒不发病的现象，仅少量出现死亡和临床症状，表明鸽源PPMV-1对鸡表现为低致病力，这与国内外多数研究结果相似。胡北侠等[21]研究发现，鸽群感染PPMV-1后，死亡率可达70%～80%，SPF鸡感染后则无明显症状，但是鸡体内可检测到PPMV-1，并可通过喉头和泄殖腔向体外排毒。OLSZEWSKA等[22]用PPMV-1分别感染鸽、鸡、火鸡后观察其组织病理学变化，病鸽出现脑组织单核细胞浸润、神经胶质细胞增生和神经元变性、水肿，肾小管坏死等病变，鸡和火鸡感染后则表现为轻微的病变。PPMV-1是NDV在鸽群中长期经历适应性进化后的产物，对鸽子有特殊宿主偏好，且对鸽的致病力强于其他家禽，PPMV-1在鸽子体内获得了比鸡源NDV更强的生存优势[23-24]。由于鸽子的迁徙性及其疫苗接种难度大，带菌、带毒鸽群极易导致其飞行区域及周边养殖场家禽发病，鸽子是NDV传播给家禽的重大威胁[25]。

综上所述，种鸽应严格按照免疫程序进行免疫，并定期监测抗体效价，这样可以为幼鸽和鸽群构建起一道有效的免疫屏障，使该地区的鸽群获得群体免疫力。同时，肉鸽养殖中应保证乳鸽饲养环境的洁净，降低各种病原入侵的机会。此外，如果鸽场发生细菌性疾病，应通过药敏试验指导临床用药、交替使用抗生素，从而提高治疗效果、减少耐药菌株的产生[26]。