晋汾白猪背最长肌肌纤维类型和能量代谢特性分析

安家岐 何志强 孙迪 李娇 赵天枝 高鹏飞 曹果清 郭晓红 蔡春波 李步高

关键词：猪；背最长肌；肌纤维类型；能量代谢；UCP3基因

肌纤维是骨骼肌的基本组成单位[1]。猪在妊娠90d时，骨骼肌肌纤维数量就已固定，出生后肌肉的生长主要是依靠肌纤维增粗和类型转化[2]。根据肌肉收缩速度与能量代谢的差异，骨骼肌肌纤维可以分为I型、IIa型、IIx型和IIb型，对应的标记基因分别为肌球蛋白重链7（Myosinheavychain7，Myh7）、Myh2、Myh1和Myh4[3]。LI等[4]研究发现，肌纤维能量代谢特性直接影响肌肉品质，不同类型肌纤维占比是影响肌肉品质的关键因素。不同猪种的骨骼肌中4种类型肌纤维组成也有明显差异，肉质品质差异也较大。刘凡等[5]研究发现，与瘦肉型商品猪相比，我国地方猪种藏猪骨骼肌中I型肌纤维含量高，IIb型肌纤维含量低，藏猪肉色鲜红，肉质较好。

解偶联蛋白3（UCP3）是一类负责质子转运的载体蛋白，分布于线粒体内膜上，可以降低线粒体内膜上的质子电化学梯度，使电子传递链和ATP合成解偶联，抑制ATP的合成。UCP3在骨骼肌、心肌和棕色脂肪组织中表达量较高，可以调控机体能量代谢[6]。HOEKS等[7]在大鼠不同代谢类型骨骼肌中研究发现，氧化能力较低的肌肉组织中UCP3基因表达水平较高；RUSSELL等[8]在耐力训练和未训练小鼠组间比较发现，UCP3蛋白主要分布在IIb型肌纤维中，I型肌纤维中的含量较低。进一步的研究发现，UCP3可以增加骨骼肌中脂肪酸的氧化代谢活性，进而调节机体的能量代谢水平[9]。SENESE等[10]在骨骼肌特异性敲除UCP3的小鼠体内研究发现，脂肪酸的氧化能力显著下降。RODR?GUEZ等[11]在禁食后的大鼠骨骼肌中发现，UCP3的表达量显著升高，脂肪酸的代谢活性也明显增强。SCHRAUWEN等[12]研究发现，酵解型肌纤维中脂肪酸氧化代谢活性明显高于氧化性肌纤维，这可能是酵解型肌纤维中UCP3基因表达量较高的重要原因之一。LIU等[13]研究发现，人的UCP3基因的启动子区域-55位点的碱基发生突变（C/T），可以有效降低肥胖症和糖尿病的发病率。近年来，UCP3基因的单核苷酸位点多态性与家畜的肉质品质、眼肌面积、系水力和大理石花纹等性状显著相关的研究也相继被报道[14-16]，但对地方猪种骨骼肌中UCP3基因表达模式的研究还相对较少。晋汾白猪是由马身猪、二花脸猪、大白猪和长白猪经过杂交选育而成，具有产仔多、生长速度快的特点，但对其骨骼肌肌纤维特性和类型组成以及能量代谢方式的研究未曾报道[17]。

本研究以晋汾白猪和大白猪为研究对象，通过检测肌纤维类型和能量代谢相关基因的表达模式，旨在探究晋汾白猪肉质品质的遗传分子机制，为晋汾白猪骨骼肌肌纤维特性和不同类型肌纤维组成以及能量代谢方式提供数据支撑。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 样品采集 断奶晋汾白猪与大白猪去势公猪各6头，于相同环境和营养水平下在山西农业大学动物实验中心饲养。6月龄屠宰，采集背最长肌组织样品，一部分组织保存于-80℃冰箱中，用于提取组织RNA；另一部分修剪为1cm×1cm×1cm的组织块，4%多聚甲醛固定后制作组织切片。

1.1.2 主要试剂及仪器 cDNA反转录试剂盒（TransScript?UniAll-in-OneFirst-StrandcDNASynthesisSuperMixforqPCR）、qRT-PCR试剂盒（PerfectStartTMGreenqPCRSuperMix）、Trizol等购于北京全式金生物技术有限公司；HE染色试剂盒购于北京智杰方远科技有限公司；石蜡、4%多聚甲醛、无水乙醇、中性树胶等购于北京索莱宝科技有限公司；UCP3单克隆抗体购自Abcam公司；β-actin单克隆抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司；荧光二抗购自美国LI-COR公司。

摊片机（KD-PIII，美国）；切片机（KD-2260，美国）；智能生物包埋机（KD-BMIV，美国）；烘片机（ZRX-DH3，中国）；高速冷冻离心机（C5415R，德国）；荧光定量PCR仪（CFX，美国），远红外光扫描系统（LI-COR，美国）。

1.2 试验方法

1.2.1 切片制备 流水冲洗4%多聚甲醛固定24h后的样品组织块，冲洗12h后用75%酒精、85%酒精、95%酒精各2h、100%乙醇1h进行梯度脱水，然后于二甲苯溶液中透明化处理1h。将组织浸入60℃蜡罐中浸蜡3h，进行包埋。使用切片机将包埋好的样品切成5μm石蜡切片，47℃条件下摊在载玻片上，然后在45℃烘箱中烘片6h。

1.2.2 HE染色 分别用二甲苯I、二甲苯II浸泡烘干的切片各2min，后依次置于无水乙醇I、无水乙醇II、95%、85%、75%酒精中进行逐级复水。苏木精染液浸染3min，并用蒸馏水洗90s；返蓝后用1%的盐酸溶液分化30s，蒸馏水洗2min，伊红染液染色3min，蒸馏水洗1min；然后依次用75%、85%、95%酒精、无水乙醇II和无水乙醇I各处理2min，逐级脱水，二甲苯I、二甲苯II中各2min进行透明，中性树胶液封片，在显微镜下观察并拍照。

1.2.3 肌纤维直径和密度的测量与分析 在每张切片上随机选择8个视野拍照，每个视野中包含100根肌纤维以上。用软件Image-ProPlus6.0進行分析，测量肌纤维的短轴和长轴，计算肌纤维的平均直径；对视野内的肌纤维计数，然后计算出单位视野内肌纤维数量的平均值，并换算成个/mm2。

1.2.4 提取总RNA与合成cDNA 采用试剂盒提取总RNA。加入20μLDEPC水溶解总RNA，4℃静置20min后测定其浓度和纯度。采用TransS?cript?UniAll-in-OneFirst-StrandcDNASynthe?sisSuperMixforqPCR试剂盒，按照说明书将每个RNA样品反转录成cDNA。第一链cDNA合成和gDNA去除：加入gDNARemover1μL，5×Trans?Script?UniAll-in-OneSuperMixforqPCR4μL，总RNA500ng，加RNase-freewater补齐至20μL，轻轻混匀后50℃孵育5min，85℃加热反应5s，失活TransScript?UniRT/RI和gDNARemover。完成后于4℃存放。

1.2.5 qRT-PCR 用Primer6.0软件设计每个基因的特异性引物，内参基因为18S，所有引物委托生工生物工程（上海）有限公司合成。引物序列如表1所示。参考实时荧光定量PCR试剂盒说明书，采用20μL体系，包括上下游引物各0.3μL，cDNA4.4μL，2×PerfectStartTMGreenqPCRSuperMix5μL，ddH2O10μL。反应程序依照PerfectStartTMGreenqPCRSuperMix说明书进行：94℃孵育30s，94℃变性5s，59℃退火反应32s，70℃反应30s，循环45次；然后94℃反应15s，65℃反应30s，95℃反应30s。用2-ΔΔCt公式计算各基因相对表达量。

1.2.6 猪UCP3基因CDS序列的扩增 以晋汾白猪背最长肌cDNA为模板，采用PCR技术扩增猪UCP3基因CDS序列。反应采用20μL体系，包括上下游引物各1μL，2×EsTaqMasterMix10μL，cDNA2μL，ddH2O6μL。PCR反应程序为：95℃孵育5min后95℃变性30s，接着60℃退火反应32s，73℃反应55s，循环38次；然后72℃反應5min。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳并分析。

1.2.7 蛋白免疫印迹 晋汾白猪背最长肌样品研磨成粉状，加入1mLRIPA裂解液，冰上裂解30min，12000r/min离心10min后得到总蛋白，使用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。蛋白样品与上样缓冲液充分混合后100℃变性10min，进行凝胶电泳。程序为：80V30min；100V80min。接着进行转膜。转膜程序为：100V90min；5%脱脂奶粉于室温摇床封闭1h；PBS洗涤3次，每次5min；加入适量一抗稀释液，其中β-actin抗体（1∶2000）和PCNA抗体（anti-Human兔多抗）（1∶1000），4℃过夜；PBS洗涤3次，每次5min；加入二抗稀释液（1∶20000），室温孵育1h；PBS洗涤3次，每次5min，然后利用远红外光扫描系统观察试验结果并拍照。

1.3 生物信息学分析

利用Signal4.0软件预测猪UCP3蛋白的信号肽。

1.4 统计分析

试验采用IBMSPSSStatistics22软件进行单因素方差分析和独立样本t检验，并分析数据差异显著性。

2 结果与分析

2.1 猪肌纤维特性分析

2.1.1 肌纤维形态分析 HE染色结果（图1）显示，晋汾白猪和大白猪背最长肌细胞质为红色，染色清晰；细胞核分布在细胞边缘，显示为蓝色；晋汾白猪骨骼肌肌纤维直径极显著低于大白猪（P<0.01），且肌纤维密度极显著高于大白猪（P<0.01）。

2.1.2 生肌调节因子和肌纤维类型标志基因表达量分析 qRT-PCR结果表明，晋汾白猪中生肌决定因子（MyogenicDeterminingfactor，MyoD）的表达量极显著低于大白猪（P<0.01），肌细胞生成素（Myogenin，MyoG）的表达量显著低于大白猪（P<0.05）（图2-A）；晋汾白猪背最长肌中Ⅱ型肌纤维标记基因Myh1、Myh2和Myh4的表达量均极显著低于大白猪（P<0.01），而Ⅰ型肌纤维标记基因Myh7的表达量极显著高于大白猪（P<0.01）（图2-B）。

2.1.3 氧化磷酸化、线粒体和糖酵解活性相关基因表达量分析 qRT-PCR结果显示，与大白猪相比，晋汾白猪背最长肌中糖酵解代谢标志基因乳酸脱氢酶A（LactatedehydrogenaseA，LDHA）和乳酸脱氢酶B（LactatedehydrogenaseB，LDHB）的表达量极显著低于大白猪（P<0.01）（图3-A）；氧化磷酸化代谢标志基因泛素-细胞色素c还原酶复合物核心蛋白2（Ubiquitin-cytochromecreductasecomplexcoreprotein2，UQCRC2）和NADH泛醌氧化还原酶A9亚单位（NADHubiquinoneoxidoreductasecoresubunitA9，NDUFA9）的表达量极显著低于大白猪（P<0.01）（图3-B）；且线粒体活性标志基因腺嘌呤核苷三磷酸ATP5A1和过氧化物酶体增殖物激活受体γ共同激活剂1α（Peroxisomeproliferatoractivatedreceptor-gammacoactivator1α，PGC1α）的表达量也极显著低于大白猪（P<0.01）（图3-C）。

2.2 晋汾白猪UCP3基因CDS序列扩增

利用PCR技术扩增猪UCP3基因的CDS序列，琼脂糖凝胶电泳结果显示，条带单一且清晰明亮，目的片段长度为927bp（图4）。分析猪UCP3蛋白与其他物种的序列一致性，按序列一致性从高到低排序依次为狼（93%）、人（90%）、牛（90%）、羊（90%）、大象（90%）、河马（90%）、大鼠（86%）、小鼠（86%）、鸡（74%）、鳜鱼（69%）。

2.3 晋汾白猪UCP3蛋白信号肽分析

信号肽预测显示（图5），猪UCP3蛋白Y-Score没有出现峰值，S-Score为0.186，小于0.5，说明猪UCP3蛋白不存在信号肽。猪UCP3蛋白的D-Score为0.181，小于0.5，表明该蛋白属于非分泌蛋白。

2.4 猪UCP3的表达特性分析

2.4.1 晋汾白猪UCP3基因的组织与时序表达特性分析 qRT-PCR结果显示，晋汾白猪UCP3基因在背最长肌和背部皮下脂肪中表达量较高，其他组织中表达量较低（图6-A）；而且出生后90d晋汾白猪背最长肌中UCP3基因的表达量明显高于出生后1、180d（图6-B）。

2.4.2 不同猪种UCP3基因表达分析 qRT-PCR和Westernblot结果表明，在mRNA水平（图7-A）和蛋白质水平（图7-C），晋汾白猪背最长肌中UCP3的表达量均低于大白猪（P<0.05）。

3 结论与讨论

肌纤维是肌肉的基本组成单位，其密度与直径呈负相关，且与肉质具有显著的相关性[18-19]。杨平贵等[20]研究发现，羊的肌纤维直径越小，肌纤维密度越大，肉质也越鲜嫩。姜雪等[21]研究发现，相比于商品猪，长白山野猪骨骼肌中肌纤维的直径和横截面积更小，肌纤维密度更大，肉质更好。本研究结果发现，与大白猪相比，晋汾白猪背最长肌中的肌纤维直径较小，密度较大，表明晋汾白猪肉质优于大白猪。

MyoD和MyoG是肌肉生成的重要调节因子，其凭借特殊的bHLH结构域能够结合许多肌肉特异性表达的基因，从而调控肌肉的生长发育。MyoD基因的缺失会导致成肌细胞无法正常分化，阻碍肌肉正常生长发育[22]；MyoG基因发生突变或缺失后，小鼠出生后立即死亡，虽然此时小鼠体内仍然存在成肌细胞，但是只有很少的肌纤维，表明MyoG基因在肌肉发育后期维持肌纤维聚合具有重要作用[23]。HUGHES等[24]研究发现，MyoG基因的过表达会使得大鼠快肌中氧化酶水平增加，糖酵解酶减少。牛姣艳[25]研究发现，马身猪背最长肌中MyoD和MyoG在出生后其表达量先升高后下降，并且其都在出生后90d表达量最高，而猪在出生后前2个月肌纤维类型会发生显著变化，所以，MyoD和MyoG基因在不同类型肌纤维中其表达有所差异。AGUIAR等[26]对小鼠进行短期训练发现，肌纤维直径增粗与MyoD（r=0.85）、MyoG（r=0.87）之间有显著正相关关系，本试验结果与前人研究结果一致，相较于大白猪，肌纤维直径较小的晋汾白猪背最长肌中MyoD和MyoG的表达量均较低，进一步表明晋汾白猪和大白猪背最长肌肌纤维类型不同。肌纤维类型与肉质品质具有显著相关性，可以调控肉色、pH、肌内脂肪含量、嫩度等[27]。骨骼肌中肌红蛋白含量是调控肉色的重要因子[28-29]。不同类型肌纤维中，肌红蛋白含量差异较大，I型和IIa型肌纤维中含量最多，IIb型肌纤维中含量相对较低[30]。HU等[31]研究发现，猪骨骼肌中I型和IIa型肌纤维含量越多，肉色越好；IIb型肌纤维所占比例越大，色泽越差。猪骨骼肌中IIb型肌纤维含量与猪肉pH值的下降速度呈显著正相关；IIb型肌纤维含量较高，肌肉pH值下降速度快，导致肌肉颜色变浅，严重影响肉品质[32-33]。HOCQUETTE等[34]研究发现，骨骼肌中I型和IIa型肌纤维含量越多，肌内脂肪含量越高，猪肉越鲜嫩多汁，口感较好。本研究发现，晋汾白猪背最长肌中IIb型肌纤维标记基因Myh4的表达量极显著低于大白猪，I型肌纤维标记基因Myh7的表达量极显著高于大白猪，表明晋汾白猪的肉质优于大白猪。

骨骼肌运动所需的ATP主要由氧化磷酸化和糖酵解代谢产生。不同类型肌纤维的氧化磷酸化和糖酵解代谢活性也不相同，I型、IIa型、IIx型和IIb型肌纤维氧化磷酸化代谢活性逐渐降低，糖酵解代谢活性逐渐升高[35]。侯艳茹等[36]研究发现，相比于舍养，放牧饲养的羊肌肉中I型和IIa型肌纤维含量较高，IIb型肌纤维含量较低，且氧化磷酸化代谢活性强。GUO等[37]研究发现，相比于6月龄大白猪，马身猪背最长肌中酵解型肌纤维标记基因的表达量显著降低，氧化型肌纖维标记基因的表达量显著升高。李忠秋等[38]研究发现，民猪背最长肌中I型和IIa型肌纤维占比显著高于大白猪，而IIb型肌纤维含量显著低于大白猪，LDH活性也显著低于大白猪。猪骨骼肌中过表达PGC1α，可以诱导线粒体的生物合成，氧化磷酸化代谢活性明显增强，I型肌纤维含量显著增加[39]。本研究发现，晋汾白猪背最长肌中氧化磷酸化和糖酵解代谢相关基因的表达量都显著低于大白猪，与以前报道并不一致。晋汾白猪是由二花脸猪、马身猪、长白猪和大白猪杂交选育的新品猪种，其遗传变异性较大，这可能是其骨骼肌糖酵解和氧化磷酸化代谢不同于纯种猪的主要原因。

UCP3是解偶联蛋白家族的成员，在维持机体产热和调控能量代谢方面起着重要作用[40]。骨骼肌中UCP3的表达量升高，可以促进肉毒碱棕榈酰转移酶1（Carnitinepalmitoyltransferase1，CPT1）的表达，促进脂肪酸氧化和脂质代谢[41]。UCP3敲除小鼠的体脂沉积显著增多，而骨骼肌中特异性过表达UCP3会降低骨骼肌中的脂肪含量[42]。UCP3的表达特性与肉质品质也具有显著的相关性。胡倩等[43]研究发现，贵州地方糯谷猪和萝卜猪的UCP3基因外显子多态性与肌内脂肪含量、嫩度、风味等性状具有显著的相关性。任亮[15]研究发现，UCP3基因编码区G395A突变与猪胸腰椎间背膘厚和肌内脂肪含量显著相关。方美英等[44]通过比较中国地方猪和商品猪UCP3基因的序列发现，猪UCP3基因的3′端调控区中SNP位点与肌肉和脂肪能量代谢存在相关性。长白和大白二元杂交猪骨骼肌中UCP3的表达量较高，ATP产生较少，糖酵解代谢较强，肌内脂肪含量较低，肌肉嫩度较差[45]。王阳等[46]研究发现，糯谷猪肌细胞中UCP3的表达量较低，骨骼肌细胞中ATP产生效率较高，对脂肪酸供能的依赖性小，肌内脂肪含量高，肉品质较好。此外，崔悦悦等[47]利用PCR方法成功扩增出杜长大UCP3编码区序列，得到了927bp的序列信息。本研究同样利用PCR技术成功扩增出晋汾白猪UCP3基因CDS区927bp全长序列，并通过蛋白信号肽预测分析其为非分泌蛋白，与其他学者研究一致。并且与大白猪比较发现，晋汾白猪中UCP3基因的表达量较低，表明晋汾白猪背最长肌氧化磷酸化代谢较强，肉质也相对较好。

相较于大白猪，晋汾白猪背最长肌肌纤维直径小，密度大，I型肌纤维标记基因Myh7的表达量高，II型肌纤维标记基因Myh1、Myh2和Myh4的表达量低，线粒体活性、氧化磷酸化、糖酵解相关基因以及UCP3基因的表达量均较低，表明晋汾白猪骨骼肌中I型肌纤维占比较高，II型肌纤维占比较低，肌纤维氧化磷酸化代谢活性强，可能是其肉质较好的一个重要原因。