芦笋茎枯病菌生物学特性与遗传多态性研究进展

孙强 曲润波 兰波 阴长发 陈洪凡 杜宜新 石妞妞 肖鸿勇 李湘民 杨迎青

关键词：芦笋茎枯病；天门冬拟茎点霉；分类地位；生长速率；致病性；遗传多态性

芦笋（AsparagusofficinalisLinn）别名石刁柏，属百合科（Liliaceae）天门冬属（Asparagus）。芦笋因其营养价值高，并具有润肺、镇咳、祛痰、抑制肿瘤生长等药理功能，被称为“蔬菜之王”[1-3]。近年来，我国芦笋产业发展很快，目前已是世界第一大芦笋生产国和出口国。据不完全统计，全国芦笋种植面积约8万hm2，鲜芦笋年产量约64万t，居世界第1位[4-6]。茎枯病是芦笋生产中的第一大病害，常常给田间芦笋带来毁灭性破坏，给广大笋农造成重大经济损失，进而还会对我国芦笋的出口和创汇造成重大冲击[7-9]。芦笋茎枯病是由天门冬拟茎点霉（Phomopsisasparagi（Sacc.）Bubak）侵染引起的[10-12]。湿热气候是该病发生和流行的首要条件，在欧美芦笋主产区均为冷凉气候，因此，茎枯病在这些国家发生较轻[13-16]。该病害在中国、日本、泰国、印尼等亚洲芦笋种植国家发生比较严重，尤其在我国发生最为严重，我国芦笋生产省份均普遍发生，而且由于我国南方气候较北方更为湿热，在我国南方产区该病发生尤为严重，轻者导致芦笋生长发育不良，降低产量与品质，重者病株提前枯死，全田毁灭[17-19]。

长期以来，一些国内外学者围绕芦笋茎枯病及其病原菌展开了多角度、多领域的研究，并取得了一些进展[17-21]。叶琪明[22]从症状、病原菌、发生规律、抗性生理和病害防治等5个方面阐述了我国芦笋茎枯病的研究现状。余智城等[23]就病害的症状、病原菌、发生规律、抗性生理和病害防治等进行了综述。张岳平等[24]综述了芦笋重要真菌病害的研究进展。郑金龙等[25]综述了芦笋茎枯病及抗病育种的研究进展。杨迎青等[26]综述了芦笋茎枯病菌致病机制的研究进展。叶艳英等[27]综述了芦笋主要病毒病的研究进展。但是由于抗病育种一直以来未有大的突破，越来越多学者开始将目光转移到芦笋茎枯病菌的致病性、遗传多态性等生物学的研究上来，并取得了可喜的成果。

笔者着重从芦笋茎枯病菌的分类地位、生物学特性和遗传多态性等3个方面简述芦笋茎枯病菌生物学方面的最新研究进展，旨在为芦笋茎枯病菌生物学领域的深入研究和有针对性地制定防控策略提供理论依据。

1 芦笋茎枯病菌分类地位

1.1 芦笋茎枯病菌分类地位的历史演化

芦笋茎枯病的病原菌最早由SACCARDO于1879年定名为PhomaasparagiSacc.。随后，有不少学者在研究中发现自己的鉴定结果与SACCARDO的命名存在出入。BUBAK于1906年提出，芦笋茎枯病的病原菌应该是拟茎点霉属（Phomopsis）的天门冬拟茎点霉。此外，TRAVERSO和SPESSA于1910年、ALCALDE于1952年和SOHI等于1975年也相继得出与BUBAK相同的结论[11]。但在1990年以前SACCARDO的定名一直被我国大陆和台湾省沿用。目前，芦笋茎枯病菌的分类地位在国内学者间已无异议，普遍认为芦笋茎枯病菌的学名为天门冬拟茎点霉[1，10-11]。

1.2 芦笋茎枯病菌的寄主范围

一些学者通过接种试验证明，天门冬拟茎点霉的侵染范围较狭窄，既不能侵染同科不同属的植物，也不能侵染同属不同种的天门冬（Asparaguscochinchinensis（Lour.）Merr）、羊齿天冬（AsparagusfilicinusHam.exD.Don）和文竹（Asparagussetaceus（Kunth）Jessop）等植物[28-29]。也有学者通过人工针刺法接种证明，天门冬拟茎点霉对百合科、芜科植物有侵染现象，其中以苋科的皱果苋（AmaranthusviridisL.）和百合科黄花（HemerocalliscitrinaBoroni.）发病明显；对其他韭菜、葱、苋菜、繁穗苋等有侵染现象，但无致病作用；而对豆科、蓼科、菊科、茄科、大戟科、马齿苋科、藜科、石竹科、旋花科、伞形科、禾本科植物无任何侵染现象[30]。

1.3 芦笋茎枯病菌的形态学鉴定

1.3.1 形态学鉴定 芦笋茎枯病主要发生在芦笋茎叶上，常常以茎部的典型症状作为田间诊断依据，尤其是侵染后期在茎部产生的小黑点（子座和分生孢子器）是该病最为重要的鉴别依据。因此，首先可以在通过田间症状识别，初步确定发生病害是否为芦笋茎枯病。然后采集病茎标本带回实验室，通过分离、培养获得病原菌菌株。采用离体接种法将分离到的病原菌接种到芦笋嫩茎上，根据离体接种是否发病以及发病后的症状与田间症状是否一致作为进一步确定的依据。刘克均等[8]通过形态学观察和人工接种鉴定，将芦笋茎枯病的病原菌鉴定为天门冬拟茎点霉，而非茎点霉。杨迎青等[11]将马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）平板培养的芦笋茎枯病菌菌丝块接种到20～30cm长的芦笋嫩茎上，25～28℃下用喷水壶喷雾保持湿度，使相对湿度保持在90%～100%，培养5～7d后观测症状发现与田间症状一致，验证了分离到的菌株为芦笋茎枯病菌。同时，杨迎青等[11]将分离培养的病原菌在PDA培养基平板上培养14～18d，待产孢后随机挑取分生孢子器30～50个、分生孢子50～100个，生物显微镜400倍下观察和测定了分生孢子的形态和大小，其形态与裘维蕃[31]对于天门冬拟茎点霉的描述一致，将其鉴定为天门冬拟茎点霉，验证了刘克均等[8]的观点。

1.3.2 芦笋茎枯病的主要识别症状 茎叶梢部是芦笋茎枯病的主要初始发病部位，之后随着病原菌的蔓延逐渐扩展到茎秆上。发病初期，侵染处首先会形成乳白色小斑点，然后逐渐扩大，形成纺锤形或椭圆形的病斑，颜色大多为浅褐色至褐色，边缘呈水渍状。随着侵染逐渐深入，病斑逐渐扩大，侵染14～18d后发病部位逐渐变为褐色到黑色，中心部位开始出现凹陷，散生出许多小黑点，即为病原菌的子座和分生孢子器。严重发生的情况下，病斑可以大到环绕茎基部7d，致使茎基部凹陷、干枯、折断，直至死亡。苗华民等[10]通过田间观察，发现芦笋茎枯病发病部位在茎和枝，初为针刺水渍状小斑点，渐扩展成菱形或不规则形褪绿斑，稍凹陷，后渐变褐色，中心灰白色，病斑边缘整齐，有失绿水渍状晕圈，10d后病斑中部密生黑色隆起的小黑点（分生孢子器），其排列多数为不规则，少数呈輪纹状排列。病斑深入髓部，绕茎一周致使其上部植株失水枯死，病茎较脆易折断。杨迎青等[11]利用人工接种方法将分离到的天门冬拟茎点霉接种到芦笋株上，接种3～5d后观察到典型病斑，并在15～18d后产生褐色至黑色的小斑点（子座和分生孢子器），与苗华民等[10]的田间观察结果一致。

1.3.3 芦笋茎枯病菌主要形态特征

1.3.3.1 菌落形态 菌落是指单个或少量微生物细胞在适宜的固体培养基的表面或内部生长繁殖到一定规模，形成以母细胞为中心的一团肉眼可见、有一定形态构造的细胞集团。菌落的形状、颜色、光泽、质地、大小、边缘和透明度等性状构成了菌落的形态特征。植物病原真菌的菌落大多较为疏松，菌丝一般较为粗长，在培养基上的排布多呈绒毛状、絮状或蜘蛛网状等，相比植物病原细菌，其菌落直径一般可以大几倍到几十倍。植物病原真菌的同属不同种或同种不同菌株在相同培养条件下的菌落形态特征往往呈现出一定的多态性。明确这些形态特征的差异对植物病原真菌不同种类的区分及遗传多态性研究具有重要意义[32]。蘆笋茎枯病菌天门冬拟茎点霉为拟茎点霉属（Phomopsis）真菌。PDA培养基平板上培养的芦笋茎枯病菌菌丝体最初呈乳白色至白色，随着培养时间的延长，菌丝体颜色逐渐加深为灰白色至淡绿色或深灰色。芦笋茎枯病菌子座深褐色至黑色，分生孢子器形成于子座中，单生或聚生，形态为扁球形至近三角形。杨迎青等[11]比较了江西、山东、福建、海南、河北等5个省芦笋茎枯病菌菌株的菌落形态。结果表明，江西省来源菌株的颜色最初为白色，随着培养时间的增加逐渐加深变为淡绿色，其他省份来源菌株的颜色最初为白色，然后随着培养时间的增加逐渐加深变为灰白色，海南省来源菌株的菌落则呈现出同心轮纹状。上述结果说明，芦笋茎枯病菌不同地域来源菌株间的菌落形态表现出丰富的多态性。

1.3.3.2 有性态 芦笋茎枯病菌分生孢子器初形成时为无色（透明状）到乳白色，随着培养时间的延长颜色逐渐加深为黄褐色、褐色至黑色，孔口突出，孔口处壁厚，具分生孢子梗。α型分生孢子大多为长椭圆形至梭形，单胞，无色，两端各有一个油球，大小为2.0～3.2μm×6.8～11.6μm[8，11]。β型分生孢子呈线形，大部分弯曲，也有直的，大多数β型分生孢子的两端也各有一个油球，大小为17.5～35.0μm×0.75～1.8μm[7，11]。采用400倍显微镜观察到的芦笋茎枯病菌α型和β型分生孢子如图1所示。

1.3.3.3 有性态培养 芦笋茎枯病菌分生孢子是利用人工接种方法对芦笋种质资源进行抗茎枯病鉴定的重要菌体材料[12]，也是从形态学上对其病原菌进行准确鉴定的重要依据之一[11]。因此，探索提高芦笋茎枯病菌分生孢子器和分生孢子产生的条件，利用最优产孢条件进行离体培养并获得产分生孢子器和分生孢子能力高的菌株，对开展该病菌形态学鉴定和芦笋茎枯病的抗性鉴定都具有非常重要的意义。

杨迎青等[11]比较了江西、山东、福建、海南、河北等5个省来源芦笋茎枯病菌菌株培养16d后产分生孢子器的数量及其所产分生孢子器的性状。从产分生孢子器的数量来说，福建省来源菌株产生的数量较多（分生孢子器的平均产生量在60个/皿），分生孢子器最初呈白色，然后随着时间的增加逐渐变为黄褐色至黑色；海南省来源菌株产分生孢子器的数量次之，尺寸较福建省来源菌株略小；江西、河北、山东等3个省来源菌株产分子孢子器的数量较少（16d后分子孢子器的平均产生量在15个/皿），其所产生的分生孢子器黑色、质硬。

顾振芳等[33]人工培养结果表明，芦笋茎枯病菌菌丝生长的适宜温度为15～30℃，最适温度20～25℃；最适pH值为6。张玉芬等[34]通过测定认为，芦笋茎枯病菌菌丝生长的适宜温度为20～30℃，最适温度25℃，在10℃和大于35℃时菌丝不能生长；20%芦笋茎叶煎汁、20%芦笋茎叶煎汁PD培养液及PD培养液均有促进孢子萌发的作用，且芦笋茎枯病菌在20%芦笋茎叶煎汁和20%芦笋茎叶煎汁PDA培养基的产孢量明显优于前人推荐的培养基和常用培养基；不同光域内分生孢子器形成有显著差异，分生孢子经2mg/L烯唑醇处理8h后，分生孢子和内含物在超微结构上发生显著变化。杨迎青等[35]采用培养基平板培养法探讨了不同因素（培养基、温度、光照和碳氮源等）对芦笋茎枯病菌产分生孢子器和分生孢子产生量的影响。结果表明，培养基、温度和光照等因素对芦笋茎枯病菌产分生孢子器和分生孢子能力的影响较大，一些氮源可显著增加芦笋茎枯病菌产分生孢子器和分生孢子的数量，而碳源对芦笋茎枯病菌产分生孢子器和分生孢子能力没有显著促进作用。

1.4 芦笋茎枯病菌的分子生物学鉴定

杨迎青等[11]利用ITS4/ITS5引物扩增了江西、山东、福建、海南、河北等5个省来源芦笋茎枯病菌菌株的ITSrDNA序列，条带大小在600bp左右。核苷酸BLAST（NucleotideBLAST）结果显示，供试菌株与基因库（GenBank）中天门冬拟茎点霉的ITSrDNA序列最高相似度为99%，供试菌株在分子生物学上被鉴定为天门冬拟茎点霉，从分子生物学角度验证了形态学鉴定的结果。

2 芦笋茎枯病菌的生长速率和致病性

2.1 生长速率

不同属之间、同属不同种之间的植物病原真菌生长速率各异，甚至同种不同菌株之间的生长速率也不尽相同。探讨植物病原真菌同种不同菌株之间生长速率的差异对研究植物病原真菌的扩展以及有针对性地制定防控策略具有重要指导意义[36]。刘克均等[1]比较了江西、山东、江苏、湖北、福建、浙江等6个省来源芦笋茎枯病菌菌株的生长速率。结果表明，江西、山东、江苏和湖北等4个省来源的芦笋茎枯病菌菌株菌丝的生长速率较快，平均菌落直径在培养5d后可达6.8～8.1cm，福建、浙江等2个省来源的菌株平均菌落直径在培养5d后只有4.0～5.0cm。杨迎青等[11]比较了江西、山东、福建、海南、河北等5个省来源的芦笋茎枯病菌菌株的菌落形态。结果表明，海南省来源菌株的生长最快，平均菌落直径在培养5d后可以达到8.5cm；江西省和福建省菌株次之，平均菌落直径在培养5d后为7.6cm；山东省和河北省来源的菌株生长较慢，平均菌落直径在培养5d后只有5.5cm。此外，YANG等[36]通过试验证明，江西、山东、福建、河北、海南、山西等6个省芦笋茎枯病菌菌株的平均菌落直径和菌丝干质量在0.05水平上存在显著差异。海南省来源菌株HN1～5的平均菌落直径较大，分布在8.43～8.61cm；江西省来源菌株XT1～5、LT1～3和福建来源菌株FJ1～5次之，平均菌落直径为7.40～7.60cm；山西省来源菌株SX6的平均菌落直径最小，在4.34cm。海南省来源菌株HN2的平均菌丝干质量最大（0.64g）；福建省来源菌株FJ1～5和海南省来源菌株HN1、HN3～5的平均菌丝干质量次之，分布在0.53～0.63g。

2.2 致病性

植物病原真菌所具有的2个基本属性是寄生性和致病性。致病性作为植物病原真菌的重要性状之一，一直在持续不断地进行遗传进化，植物病原真菌致病性的进化就是对植物的适应和二者共同进化的过程[36]。因此，植物病原真菌不同菌株致病性的明确对开展遗传育种及有针对性地防控该病害具有极其重要的意义[12]。刘克均等[1]成功在芦笋茎秆天然培养基上培养了芦笋茎枯病菌，并从培养基上刮下子座和分生孢子器，置于研钵中加入新鲜芦笋汁液后研磨，用无菌水稀释将浓度调节到高倍视野中3～4个孢子，芦笋茎枯病菌的致病力采用分生孢子喷雾接种法进行测定。杨迎青等[12]在PDA培养基平板上采用纯培养的方式获取了芦笋茎枯病菌分生孢子器，用无菌载玻片将分生孢子器从PDA培养基平板上轻轻刮下，用少量无菌水洗下后转至无菌研磨器中磨碎，经无菌3层纱布过滤后通过血球计数板计数确定分生孢子悬浮液的浓度，加入定量无菌水调节分生孢子浓度到1×106个/mL。同时，YANG等[36]通过比较芦笋茎枯病菌不同省域来源菌株的致病力，发现芦笋茎枯病菌不同菌株间的致病力差异显著，但与菌株的地域来源无明显相关性。

3 芦笋茎枯病菌的遗传多态性

3.1 基于致病力的遗传多态性

以感病芦笋种质资源作为受体材料，通过人工接种方法测定芦笋茎枯病菌不同地域来源菌株的致病力。根据供试种质资源对不同芦笋茎枯病菌菌株的抗/感性，将其分别转换成0/1表示，0表示抗病（R），1表示感病（S），将相关数据汇总得到“0/1”表。选用软件NTsys-PC1.8的SAHNclustering程序，利用非加权成组配对算术平均法（Unweightedpair-groupmethodwitharithmeticmeans，UPGMA），计算并获得芦笋茎枯病菌不同地域来源菌株的相似性系数矩阵和聚类图。同时也可以通过获得矩阵和聚类图对不同地域来源芦笋茎枯病菌菌株的致病力分化规律加以研究和分析，以明确芦笋茎枯病菌不同地域来源菌株致病性遗传规律[36-37]。

YANG等[36]研究了江西、山东、福建、山西、海南、河北等6个省来源芦笋茎枯病菌菌株的致病力分化规律，结果显示，不同菌株的致病力在0.05水平上差异显著，菌株FJ2的致病力最强（平均病情指数为75.33），菌株HN2和SD4次之（平均病情指数分别为74.07和73.88），SD5的致病力最弱（平均病情指数为42.16）。未发现芦笋茎枯病菌菌株的致病力分化与菌株来源呈现出显著相关的规律，具体相关性尚待进一步深入研究。

陈建等[37]从江西、山东、福建、山西、海南、河北等6个省来源的芦笋茎枯病菌菌株中，每省随机选取2个菌株作为代表性菌株，共选取了12个代表性菌株，采用分生孢子喷雾接种法将12个菌株依次接种到31个供试芦笋种质资源的1月龄幼苗（株高10～25cm）上，暗室中利用喷雾法将相对湿度保持在90%～100%，培养1～2d后转到25～28℃智能温室内继续培养，用加湿器保持相对湿度在90%～100%，10～15d后按照苗期病情7级分级标准调查和统计病级，并计算病情指数。根据31个供试芦笋种质资源对茎枯病的抗/感性，将其转换成0/1表。用UPGMA法分析了31个芦笋种质资源的抗病性并获得了基于31个芦笋种质资源对茎枯病抗/感性的聚类图，将所有供试芦笋种质资源划分为4个组群。4个组群中每个组群选取1个种质资源作为鉴别寄主。陈建等[37]的研究结果不仅为芦笋茎枯病菌遗传多态性的研究提供了理论依据，而且印证了其构建鉴别寄主的稳定性和可操作性，为进一步研究芦笋茎枯病病菌和芦笋品种之间的基因互作及芦笋种质资源抗茎枯病的遗传育种奠定了基础。

3.2 基于rDNAITS序列的遗传多态性

杨迎青等[11]探讨了芦笋茎枯病菌不同省份来源菌株的系统进化规律。通过聚类，江西、山东、福建、河北和海南等5个省来源的菌株被划分为2大组群：山东、江西、福建和海南等4个省来源的菌株聚为1个组群，河北省来源菌株单独聚为1个组群。说明芦笋茎枯病菌在省域间呈现出显著的遗传分化，在分子水平上证明了芦笋茎枯病菌存在地域分化。拟茎点霉属（Phomopsis）、镰刀菌属（Fusarium）、炭疽菌属（Colletotrichum）、青霉属（Penicillium）、木霉属（Trichoderma）、曲霉属（Aspergillus）和茎点霉属（Phoma）等属真菌分别按属独立聚为1个组群，说明同属植物病原真菌间的rDNAITS较为相近，其亲缘关系较近；与天门冬拟茎点霉亲缘关系最近的是叶下珠生拟茎点霉（P.phyllanthicola），属于拟茎点霉属，从而证实了芦笋茎枯病的病原菌应归属于拟茎点霉属，而非茎点霉属。

3.3 基于ISSR分子标记技术的遗传多态性

简单序列重复区间扩增多态性（Inter-simplesequencerepeat，ISSR）是在简单重复序列（SSR）基础上发展起来的，由于其众多优点越来越受到科技工作者的欢迎，它是由加拿大蒙特利尔大学的ZIETKIEWICZ等在1994年提出的[38]。现已广泛应用于系统进化分析、遗传多样性与群体遗传结构分析、基因定位、遗传作图、分子标记辅助育种、植物种质资源鉴定等多方面研究中[39-40]。

YANG等[36]从哥伦比亚大学公布的100条ISSR引物中筛选出了4条引物，这4条引物在芦笋茎枯病菌的ISSR-PCR扩增中表现出较强的特异性和较好的可重复性。利用筛选出的4条引物对芦笋茎枯病菌6个省来源菌株进行了ISSR-PCR扩增，获得了DNA指纹图谱，其片段在300～3500bp。通过聚类分析数据显示，芦笋茎枯病菌邻近省份来源菌株呈现出较近的亲缘关系，证明了芦笋茎枯病菌系统演化与不同地域环境条件存在相适应的遗传进化规律。

4 前景与展望

近年来，越来越多的学者认识到植物病原真菌生物学特性和致病性等在遗传育种中的重要地位。芦笋茎枯病在全球范围内是一种区域性分布的毁灭性病害，俗称“芦笋癌症”。国内外一些学者着手从芦笋茎枯病菌分类地位、生物学特性及遗传多态性等方面展开了深入的研究。目前对芦笋茎枯病菌的生物学领域的研究大多围绕菌落形态、生长速率、分生孢子器和分生孢子产生量等方面展开，但芦笋茎枯病菌生物学相关调控基因的克隆、功能及表达等方面的研究尚需深入。此外，蘆笋茎枯病菌遗传多态性方面的研究还不够深入，一些新型研究方法尚未在芦笋茎枯病菌遗传多态性的研究中得以应用和验证。总之，芦笋茎枯病菌生物学特性、致病性和遗传多态性等方面的探讨，对于有针对性地防控芦笋茎枯病及指导遗传育种具有重要的理论与实践意义，充分展现了其广阔的应用前景。