黄芪根腐病尖孢镰刀菌LAMP可视化快速检测方法的建立

梁伊菲 王春伟

关键词：环介导等温扩增（LAMP）；尖孢镰刀菌；黄芪；根腐病；可视化；快速检测

由于轮作周期缩短、连作面积连续增加，黄芪根腐病在山西、甘肃、内蒙古等黄芪主产区已普遍发生[1]，严重制约黄芪产业持续性发展[2-4]。高芬等[1]调查表明，黄芪在整个种植季会受到多种镰刀菌的侵染，其中，尖孢镰刀菌（Fusariumoxysporum）是主要病原菌之一。尖孢镰刀菌是世界性分布的土传病原真菌，有多种专化型和生理小种，不同生理小种致病力有差异，存在生理小种分化[5]，可引起甘草、西瓜、番茄、草莓、香蕉及花卉等100多种植物发病[6-11]。

目前，对尖孢镰刀菌的鉴定多通过PCR、荧光定量PCR技术[12]实现，伍文宪等[11]通过PCR方法针对镰刀菌核糖体DNA中IGS序列间的差异，设计了1对特异性引物P_1/P_2，通过该检测方法可从尖孢镰刀菌中扩增出条带，同时测定出尖孢镰刀菌的检测阈值为100pg。但PCR技术所用时间较长，需要通过凝胶电泳检测，结果判定需要3～4h才能完成。黄怀冬等[12]改进了测定土壤中尖孢镰刀菌的荧光定量PCR方法，用尖孢镰刀菌的孢子悬浮液和连续栽种的稻土制作成带菌土，使用强力土壤DNA提取试剂盒从中提取DNA。根据引入预PCR前后所绘制的标准曲线可知，该方法令土壤中尖孢镰刀菌的检测下限提高了10倍。荧光定量PCR可对结果准确定量，但仪器昂贵，对操作人员的技术有一定的要求，在基层的使用条件受限，因此，不适合在田间推广和应用。

NOTOMI等[13]研发的环介导等温扩增（LAMP）可在恒温（60～65℃）下，利用链置换型DNA聚合酶针对目标核酸靶序列进行快速扩增，是一种快速经济、特异性强的DNA扩增方法。杨科等[5]通过LAMP检测西瓜上的尖孢镰刀菌西瓜专化型（FON），其检测下限与姚锦爱等[14]对尖孢镰刀菌的检测一致，但仅能对西瓜幼苗是否被FON侵染作出正确判断。针对黄芪上由尖孢镰刀菌引起的根腐病的LAMP快速检测方法目前未见报道。

本试验针对黄芪上分离出的尖孢镰刀菌TEF-1alpha基因的特定靶向区域设计特异性引物，通过对反应温度和时间优化，以期建立黄芪根腐病的可视化快速检测体系。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株 2019年采集到黄芪根腐病样品，从中分离获得尖孢镰刀菌（Fusariumoxysporum）菌株，并通过柯赫氏法完成致病性测定。特异性检测试验中用到的木贼镰刀菌（Fusariumequiseti）、锐顶镰刀菌（Fusariumacuminatum）、层出镰刀菌（Fusariumproliferatum）、砖红镰刀菌（Fusariumlat?eritium）、变红镰刀菌（Fusariumincarnatum）、禾谷镰刀菌（Fusariumgraminearum）、枝孢菌（Clado?sporiumanthropophilum）、茄腐镰刀菌（Fusariumsolani）、轮枝镰刀菌（Fusariumverticillioides）和半裸镰刀菌（Fusariumsemitectum）均由山西农业大学植物病理重点实验室分离鉴定并保存。以上菌株均保存于PDA试管斜面，4℃冰箱中保存备用。

1.1.2 试剂及仪器 Biospin真菌基因组DNA提取试剂盒、LAMPMasterMix试剂盒（生工生物工程（上海）股份有限公司），SYBRGreenI核酸染料（北京索莱宝科技有限公司），NaOH，95%HCl，Tris，ddH2O。

HH-2水浴锅（国华电器有限公司），C1000TouchThermalCyclerPCR仪（上海柏辰生物科技有限公司），Centrifuge5810r离心机（德国Eppendorf公司），三用紫外分析仪（上海嘉鹏科技有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 LAMP引物设计 基于TEF-1alpha基因序列与Fusarium属的相关序列构建的系统发育树，结果如图1所示。

从黄芪根腐病样品中分离获得的Fusariumoxysporum与MRC1964、MRC2325、MRC2066、MRC2199和MRC2536聚于同一分支，明显远离Fusarium属的其他种。因此，可以通过TEF-1alpha基因序列区分不同镰刀菌种。此外，将从NCBI获取的尖孢镰刀菌TEF-1alpha基因序列与其他镰刀菌进行比对，针对TEF-1alpha基因序列，使用引物设计软件PrimerExplorerV5设计特异性引物：1对内侧引物FIP（F1c＋F2）和BIP（B1c＋B2）、1对外侧引物F3和B3和1对环引物LoopF和LoopB（表1）。

1.2.2 DNA提取 用Biospin真菌基因组DNA试剂盒提取所有供试菌株DNA。

1.2.3 LAMP體系优化 反应体系如表2所示，其中，FIP、BIP、LoopF、LoopB、F3和B3提前混合作为预混液。

将0.5μLSYBRGreenⅠ滴加在管盖上，置于恒温水浴锅中反应。为优化LAMP反应体系，将其反应温度分别设置为60、61、62、63、64、65℃，反应时间分别设置为15、30、45、60、75min。待反应结束后，振荡离心管将反应体系与SYBRGreenⅠ混匀，观察254nm紫外灯下的荧光反应以及1%琼脂糖凝胶电泳结果，每个试验重复3次。

1.2.4 LAMP灵敏度检测 用DNA质量浓度测定仪测定尖孢镰刀菌DNA质量浓度。用ddH2O将得到的DNA浓度依次稀释为10、1ng/μL以及100、10、1pg/μL和100fg/μL，分别取1μL作为LAMP检测方法的反应模板，进行灵敏度检测并观察紫外灯下的荧光反应。

1.2.5 PCR灵敏度检测 采用PCR技术作为灵敏度对照，质量浓度为10ng/μL～100fg/μL，检测其反应灵敏度的下限，通过1.0%琼脂糖凝胶电泳得到结果。

1.2.6 LAMP特异性检测 将上述11种供试菌株的DNA在优化的反应条件下进行LAMP扩增。反应结束后，观察反应的特异性结果。

1.2.7 碱裂解法提取DNA 取0.2g的患病黄芪根部组织，加入2mLNaOH并在研钵中研磨成糊状。将糊状物质转移到1.5mL的离心管中，在离心机中于12000r/min离心6min。离心后取5μL的上清液与495μL的0.1mol/LTris-HCl（pH=8.0）混合均匀。取1.0μL混合物作为模板DNA进行LAMP反应。

2 结果与分析

2.1 反应温度的优化

结果表明，在60～65℃的温度范围内，LAMP反应呈阳性，凝胶电泳条带呈阶梯状。观察发现，在62℃下，LAMP反应的凝胶电泳条带最清晰（图2-A），在紫外灯下产生的绿色荧光强度最大（图2-B）。

2.2 反应时间的优化

在62℃条件下，设置反应时间范围为15～75min，观察到反应时间为15min时，反应为阴性，琼脂糖凝胶中未出现扩增条带（图3-A），且无荧光反应（图3-B）；反应时间为30min时，扩增条带最清晰、且荧光强度最大。

2.3 检测LAMP与PCR方法的灵敏度

在优化的反应条件下，用TEF-1alpha基因部分序列进行LAMP检测，确定LAMP的检测下限，通过1.0%琼脂糖凝胶电泳（图4-A）观察扩增结果和在紫外灯下观察显色反应（图4-B），结果表明，该LAMP方法检测灵敏度为10pg/μL。

设置DNA质量浓度为10ng/μL～100fg/μL，检测PCR反应灵敏度下限，通过1.0%琼脂糖凝胶电泳，结果表明（图5），其灵敏度为100pg/μL。

2.4 检测LAMP引物的特异性

11种供试菌株在上述试验得到的最适温度（62℃）和最适时间（30min）条件下，用尖孢镰刀菌的3对引物进行扩增和检测，以ddH2O代替模板DNA作为阴性对照，结果表明（图6），除尖孢镰刀菌外，其余供试菌株扩增后均无电泳条带（图6-A），且在紫外灯下呈现橘色（图6-B），其LAMP反应结果同阴性对照一致，说明该LAMP方法对尖孢镰刀菌具有较高的特异性。

2.5 检测发病组织

使用LAMP方法检测9份样品，包括接种样品、发病样品和未感染样品各3份，用碱裂解法提取DNA进行LAMP检测，结果显示（图7），所有染病样品和接种样品的LAMP检测均出现阶梯状条带。此外，该方法还可用于检测田间患病植株上的尖孢镰刀菌。

3 结论与讨论

镰刀菌是一种世界性的土传真菌，可引起多种植物枯萎病或根腐病的发生[15-19]，近几年有关于使用LAMP技术检测尖孢镰刀菌的报道，但大多集中于各种专化型，还有部分对草莓、柑橘等经济作物以及多肉植物上尖孢镰刀菌的报道[19-23]，而针对黄芪上尖孢镰刀菌的检测技术未见报道。

本研究首次利用LAMP技术检测黄芪根腐病，同时在研究中优化LAMP反应体系，确定了扩增尖孢镰刀菌DNA片段的最适反应时间为30min和最适反应温度为62℃。使用LAMP方法测定的检测下限为10pg/μL，比伍文宪等[11]通过PCR方法测定尖孢镰刀菌的检测下限高10倍。姚锦爱等[14]针对尖孢镰刀菌建立的检测体系需用时2h，而本研究中的快速检测体系仅用时70min，检测时间缩短了50min且检测下限一致。黄熊娟等[16]和邓晟等[17]研究尖孢镰刀菌专化型检验试剂盒，李信申等[18]测定了在芝麻、花生、马铃薯等作物上的檢测下限，用LAMP方法可在60min内扩增出尖孢镰刀菌的目标基因，而使用本研究中的快速检测体系仅在30min内就扩增出目标基因。本研究还提出将LAMP引物预先混合的思路，因3对引物在添加时处于相邻位置，且在设计引物时避免了引物与引物之间形成稳定的二聚体或发夹结构，所以，可以将其预先混合。试验证明，可以使用预混液代替常规LAMP体系建立时依次加入的3对引物。

可视化检测常用于病害的快速诊断。模板DNA经过扩增后加入SYBRGreenI，阳性样本出现绿色荧光，而阴性样本呈现橙色。LIUYING等[24]、王芝涵等[25]针对玉米穗腐病上的温和镰刀菌进行LAMP检测，在扩增后加入SYBRGreenI，观察到反应体系颜色变化在紫外光与自然光下一致；但反应后加入SYBRGreenI，可能导致气溶胶污染，使体系出现假阳性反应，从而干扰扩增结果的判定。本研究中，在LAMP扩增前加入SYBRGreenI，不仅可直观呈现扩增结果，而且可避免假阳性反应；同时，其反应结果与凝胶电泳结果一致，也不需要复杂的设备和操作。因此，在反应开始前加入SYBRGreenI不仅使反应结果可视化，还可大大节省检测所需的时间。

在LAMP检测中，特定的靶向区域对于区分不同的物种至关重要[24-25]。TEF-1alpha是一种高度保守且普遍存在的蛋白，已被广泛应用m于研究镰刀菌属的种内和种间变异和系统发育[25]。根据系统发育树可知，从黄芪根腐病样品中分离获得的尖孢镰刀菌明显远离Fusarium属的其他种。因此，以TEF-1alpha区域为靶点设计LAMP引物是合适的。研究表明，所设计的引物对尖孢镰刀菌具有较高的特异性。本研究利用尖孢镰刀菌的TEF-1alpha蛋白设计了一套引物，并结合碱裂解快速提取DNA方法，建立了尖孢镰刀菌的LAMP快速检测体系。田间实际样品检测试验表明，该LAMP体系具有较好的重复性和稳定性，能对黄芪根部是否被尖孢镰刀菌侵染作出正确判断。