苦荞转录因子基因FtbHLH3的克隆、亚细胞定位及表达分析

吕秋谕 孙培媛 冉彬 王佳蕊 陈庆富 李洪有

（贵州师范大学荞麦产业技术研究中心，贵阳 550001）

苦荞（Fagopyrum tataricum（L.）Gaertn）是一种起源于我国西南地区的重要药食同源小杂粮作物，其种子含有较为丰富的生物活性黄酮类化合物（1%-3%），具有降“三高”、消炎、抗氧化、抗病毒、抗动脉硬化、抗糖尿病、抗癌防癌等多种保健功能［1-2]。类黄酮作为苦荞中最主要的保健和品质成分，其含量直接影响着苦荞的品质。因此，发掘苦荞类黄酮生物合成调控基因，解析其分子调控机制对高黄酮苦荞新品种培育具有重要意义。

大量研究表明，植物MYB（v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog）和bHLH转录因子在类黄酮生物合成中具有重要调控作用［3-4]。bHLH转录因子是植物中第二大转录因子家族，其中最早被功能鉴定调控类黄酮生物合成的是玉米（Zea mays）的ZmB和ZmR，它们通过正调控类黄酮生物合成结构基因ZmA1（DRF）和ZmBz1（UFGT）的表达来调控花青素的生物合成［5]。继玉米ZmB和ZmR被鉴定后，迄今调控类黄酮生物合成的bHLH转录因子已在拟南芥（Arabidopsis thaliana）（TT8、GL3和EGL3）等30余种植物中被鉴定［6-15]。在所有鉴定的bHLH转录因子中，除羊草（Leymus chinensis（Trin.）Tzvel）LcbHLH92可能通过调控LcTT8基因的表达来负调控原花青素和花青素的生物合成外［15]，其余bHLH转录因子均通过直接调控类黄酮生物合成后期结构基因（DFR、LAR、ANS、ARN和UFGT）的表达来正调控或负调控原花青素或花青素的合成。此外，几个鉴定的bHLH转录因子，如玉米ZmR［5]和ZmIn1［16]、杨梅（Myrica rubra（Lour.）S. et Zucc）MrbHLH1［17]、萝卜（Raphanus sativus L.）RsTT8［8]、钝鳞紫背苔（Plagiochasma）PabHLH1［10]、梨（Pyrus spp.）PpbHLH64［14]等除调控类黄酮生物合成后期结构基因表达外，还直接调控了类黄酮生物合成早期结构基因（CHS、CHI、F3H、F3'H）的表达，暗示植物bHLH转录因子可能还参与调控了原花青素和花青素外的其他类黄酮的生物合成。值得注意的，除羊草的LcbHLH92［15]和梨PpbHLH64［14]外，所有已鉴定的bHLH转录因子均属于植物bHLH转录因子家族的IIIf亚家族，它们通常需要与MYB类转录因子互作后才具有调控类黄酮生物合成的功能［1,18]。因此，发掘植物中调控类黄酮生物合成的非IIIf亚家族bHLH转录因子，对拓展人们对bHLH转录因子调控植物类黄酮生物合成的分子机制的认识具有重要意义。

目前，在苦荞类黄酮生物合成调控研究方面，一些MYB转录因子已被鉴定调控了苦荞类黄酮的生物合成。其中，FtMYB1、FtMYB2、FtMYB15通过正调控DFR、ANS和负调控FLS基因的表达来正调控原花青素和花青素的生物合成［19-20]，而FtMYB3、FtMYB8和FtMYB18则通过抑制原花青素和花青素合成结构基因的表达来负调控原花青素和花青素的生物合成［21-23]。相比较，FtMYB116、FtMYB31、FtMYB6、FtMYBF通过直接激活黄酮醇生物合成基因F3'H、F3H、FLS和UFGT的表达来正调控黄酮醇芦丁、槲皮素、山奈酚、杨梅素等的生物合成［24-28]，而FtMYB11、FtMYB13、FtMYB14、FtMYB15 和FtMYB16则负调控黄酮醇芦丁的生物合成［29-31]。虽然苦荞中已有10余个MYB转录因子被功能鉴定调控了苦荞类黄酮生物合成，但迄今未见其他类型转录因子尤其是bHLH类转录因子参与调控类黄酮生物合成相关报道。因此，开展苦荞类黄酮生物合成相关的特别是不属于植物中已报道的全新bHLH转录因子的鉴定，对全面解析苦荞类黄酮生物合成的分子调控机制具有重要意义。

在前期的研究中，通过转录组和代谢组关联分析，从苦荞中鉴定到一个非IIIf亚家族bHLH转录因子基因FtbHLH3（FtPinG0000754600.01），可能参与调控苦荞类黄酮的生物合成［32]。本研究在此基础上，从苦荞中克隆了该基因，并对其进行了生物信息学、转录特性、亚细胞定位、基因共表达、基因表达量与总黄酮含量间相关性分析，旨在为进一步研究其生物学功能及其分子调控机制提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试植物材料为苦荞品种‘黑苦013号’和本氏烟草［Nicotiana benthamiana（K.）] 。质粒pMD19-T购自TaKaRa公司，pGBKT和16318-hGFP质粒由本实验室保存。大肠杆菌（Escherichia coil）DH5α、根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）GV3101和酵母菌株AH109由本实验室保存。

1.2 方法

1.2.1 总RNA的提取和第一链cDNA（complementary DNA）合成 利用多糖多酚植物总RNA提取试剂盒（TIANGEN，北京）提取‘黑苦013’成年植株不同组织部位（茎、顶端1叶、顶端3叶、花，授粉后7、13、16 d的种子）的总RNA。用PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒（TaKaRa，大连），以顶端3叶总RNA为模板，反转录合成用于基因克隆的第一链cDNA。用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒（TaKaRa，大连），以各组织部位的总RNA为模板，反转录合成用于荧光定量的第一链cDNA。

1.2.2 FtbHLH3全长CDS序列克隆 根据苦荞基因组中FtbHLH3的参照CDS序列，利用Primer Premier 5.0 软件设计扩增目标基因的特异引物FtbHLH3F1和FtbHLH3R1（表1）。利用KOD高保真酶，以叶cDNA为模板进行PCR扩增，扩增完成后用Tap酶进行加A反应。利用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，回收目的片段并连接pMD19-T载体上，转化大肠杆菌感受态DH5α。转化子经PCR检测后，送阳性克隆至生工生物工程（成都）股份有限公司测序。

表1 本研究所用引物序列Table 1 Primer sequences used in the study

1.2.3 FtbHLH3的生物信息学分析 用在线软件ORFfinder（https://www.ncbi.nlm.nih. gov/orffinder）查询FtbHLH3的开放阅读框（open reading frame,ORF）；用BioXM 2.6软件预测其编码蛋白的等电点和分子量大小；用ProtScale 软件分析其亲/疏水性；通过NCBI数据库进行FtbHLH3同源比对和保守结构域查询；用MEGA 7.0.21软件，通过最大似然法（ML）构建FtbHLH3蛋白的系统进化树。

1.2.4 FtbHLH3的亚细胞定位 设计分别带Sal I和BamH I酶切位点的FtbHLH3的上下游特异引物FtbHLH3F2和FtbHLH3R2（表1），以测序正确的pMD19-T-FtbHLH3质粒为模板进行PCR扩增。然后，用Sal I和BamH I对PCR产物和16318-GFP空载体进行双酶切，纯化回收酶切产物并用T4 DNA连接酶连接，构建35S∷FtbHLH3-GFP亚细胞定位载体。亚细胞定位具体操作参照孙小倩等［28]的方法进行。

1.2.5 FtbHLH3的转录激活活性分析 设计分别带EcoR I和BamH I酶切位点的FtbHLH3的上下游特异引物FtbHLH3F3和FtbHLH3R3（表1），以测序正确的pMD19-T-FtbHLH3质粒为模板进行PCR扩增。随后，通过双酶切法将FtbHLH3连接到pGBKT7载体上，构建酵母表达载体pGBKT7-FtbHLH3。将pGBKT7-FtbHLH3、pGBKT7（阴性对照）和pGBKT7-53（阳性对照）质粒利用LiAc法分别转化酵母菌株AH109，并在SD/-Leu-Trp、SD/-Ade-His-Leu-Trp和含有 X-α-gal的SD/-Ade-His-Leu-Trp培养基上培养 5 d，观察并拍照。

1.2.6 FtbHLH3与苦荞类黄酮生物合成结构基因的共表达分析 利用Li等［32]和Zhang等［33]发表的转录组数据，获得FtbHLH3和另外36个在种子差异表达的bHLH转录因子基因及14个苦荞类黄酮生物合成结构基因（3个CHS、1个CHI、2个F3H、2个F3'H、1个F3'5'H、1个FLS、1个ANS、1个ANR、1个DFR和1个LAR）在苦荞不同组织（根、茎、叶、花和3个发育时期种子）的FPKM表达值，用TBtools进行基因表达聚类分析，确定FtbHLH3与苦荞类黄酮生物合成结构基因的共表达关系［28,32-33]。

1.2.7 FtbHLH3在苦荞不同组织部位中的表达分析及总黄酮提取 设计FtbHLH3的实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR, RT-qPCR）引物FtbHLH3qF和FtbHLH3qR。利用SYBR® Premix Ex TaqTM II试剂盒，以苦荞‘黑苦013’成年植株的茎顶端1叶、顶端3叶、花、授粉后7、13和16 d的种子cDNA为模板，FtActin7为内参基因进行荧光定量分析，检测FtbHLH3在苦荞不同组织部位的表达情况。各样品的总黄酮的提取及测定参照吕丹等［34]的方法进行。

1.2.8 FtbHLH3在苦荞不同组织部位中的表达量与总黄酮含量间的相关性分析 利用Excel中的单因素方差分析法分析FtbHLH3表达量在不同组织间的差异显著性和总黄酮含量在不同组织部位间的差异显著性，当P ＜ 0.05时认为有显著性。利用EXCEL2013和AI软件进行作图。

2 结果

2.1 FtbHLH3的克隆及其编码蛋白的特征分析

利用基因特异引物FtbHLH3F1和FtbHLH3R1，以苦荞成年植株顶端3叶cDNA为模板，通过RTPCR扩增到一条约750 bp的条带，与预期条带大小相似（图1）。测序结果显示，该条带与参照序列完全一致，大小为783 bp，编码260个氨基酸。BioXM 2.6和ProtScale分析表明，FtbHLH3蛋白理论分子量为29.34 kD，等电点为6.07，为疏水性蛋白。通过NCBI中的Conserved Domain数据库分析FtbHLH3和拟南芥中已知的类黄酮生物合成相关的bHLH转录因子TT8、GL3、EGL3、MYC2和它们在苦荞中的同源蛋白的保守结构域，结果表明FtbHLH3蛋白含有bHLH转录因子的保守结构域，而其他蛋白除含有bHLH转录因子的保守结构域外，还含一个与MYB转录因子互作的保守结构域。

图1 FtbHLH3的克隆Fig. 1 Cloning of FtbHLH3

2.2 FtbHLH3的系统进化分析

根据文献和NCBI数据库，获得植物中已知功能的调控类黄酮生物合成的bHLH转录因子的蛋白序列，同时通过拟南芥tair数据库获得FtbHLH3在拟南芥中的同源蛋白AtbHLH3a和AtbHLH3b的蛋白序列，利用MEGA 7.0软件以最大似然法构建系统进化树。结果如图2所示，在所有已知的调控类黄酮生物合成的bHLH转录因子中，除羊草LcbHLH92 与bHLH转录因子家族IVd亚家族成员聚为一支，其他蛋白均聚在IIIf亚家族分支上。相比较，FtbHLH3与其拟南芥同源蛋白AtbHLH3a和AtbHLH3b单独聚为一支。

图2 FtbHLH3与已知的调控类黄酮生物合成的bHLH蛋白的系统进化树Fig. 2 Phylogenetic tree of FtbHLH3 and known bHLH protein regulating flavonoid biosynthesis

2.3 FtbHLH3的蛋白亚细胞定位分析

将构建好的35S∷FtbHLH3-GFP载体和16318-GFP空载体（对照）通过农杆菌介导法注射侵染本氏烟草叶片，进行瞬时表达，在共聚焦显微镜下观察GFP荧光信号。结果如图3所示，空载体的荧光信号分布在细胞膜、细胞质和细胞核上，而35S∷FtbHLH3-GFP的荧光信号只分布在细胞核上，表明FtbHLH3定位于细胞核。

图3 FtbHLH3亚细胞定位Fig. 3 Subcellular localization of FtbHLH3

2.4 FtbHLH3的转录激活活性分析

通过LiAc转化法将pGBKT7-FtbHLH3、pGBKT7（阴性对照）和pGBKT7-53（阳性对照）质粒分别转化酵母菌株AH109中检测FtbHLH3的转录激活活性。结果（图4）显示，pGBKT7-FtbHLH3、pGBKT7和pGBKT7-53在SD/-Leu/-Trp二缺培养基上均能生长，但在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp四缺培养基上只有阳性对照pGBKT7-53能生长，且其在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/x-α-gal培养基上显蓝色，表明FtbHLH3不具有转录激活活性。

图4 FtbHLH3在酵母中转录自激活活性鉴定Fig. 4 Identification of transcriptional self-activation activity of FtbHLH3 in yeast

2.5 FtbHLH3与苦荞类黄酮生物合成结构基因的共表达分析

利用公共可用的转录组数据，对FtbHLH3和另外36个在种子中差异表达的bHLH转录因子基因及14个类黄酮生物合成结构基因进行共表达分析。结果（图5）显示，FtbHLH3与3个bHLH转录因子基因（包含拟南芥类黄酮生物合成关键调控转录因子基因TT8的同源基因FtTT8）、12个类黄酮生物合成结构基因（3个CHS、1个CHI、2个F3H、2个F3'H、1个ANS、1个ANR、1个DFR和1个LAR）共表达，它们均在根、茎、叶和授粉后13 d的种子中高表达。表达相关性分析显示，FtbHLH3和FtTT8分别与9个和10个类黄酮生物合成结构基因间存在显著正相关（r＞0.8，P＜0.05），且其中8个类黄酮生物合成结构基因与FtbHLH3和FtTT8均存在显著正相关（表2）。

图5 FtbHLH3与苦荞种子差异表达bHLH转录因子基因和类黄酮生物合成结构基因的表达聚类热图Fig. 5 Expression cluster heat map of FtbHLH3, differentially expressed transcription factor bHLH genes and flavonoid biosynthesis structure genes in tartary buckwheat seeds

表2 FtbHLH3与类黄酮生物合成结构基因表达相关系数Table 2 Correlation coefficient between FtbHLH3 and flavonoid biosynthesis structure gene expression

2.6 FtbHLH3在苦荞不同组织部位中的表达量与总黄酮含量间的相关性分析

利用实时荧光定量 PCR分析FtbHLH3在苦荞成年植株不同组织部位中的表情况，结果如图6-A所示，FtbHLH3在叶、授粉后13 d的种子和茎中高表达，与转录组数据相符。总黄酮含量分析表明（图6-B），苦荞顶端3叶总黄酮含量最高（5.37%），随后依次为顶端1叶（3.90%）、茎（3.68%）、授粉后13 d种子（3.07%）、授粉后16 d种子（2.56%）、授粉后7 d种子（2.09%）和花（1.33%）。FtbHLH3表达量与总黄酮含量相关性分析显示（图6-C），在不同组织部位中FtbHLH3的表达量与总黄酮含量显著相关（R2=0.81，P=0.01）。

3 讨论

苦荞是一种重要的小杂粮，其含有丰富的黄酮类化合物，具有极高的保健作用。近年来，有关苦荞黄酮化合物生物合成的分子机制研究已成为苦荞分子生物学领域的研究热点。随着苦荞基因组的解析，苦荞黄酮化合物生物合成途径已基本明晰，大多数黄酮生物合成结构基因已被功能验证［33,35-37]。此外，多个调控苦荞黄酮化合物生物合成的调控基因也被鉴定，但它们主要是MYB类转录因子［19-31]。大量研究表明，bHLH转录因子在植物黄酮化合物生物合成中也具有重要的调控作用［3-4]。然而，目前苦荞中未见参与调控黄酮化合物生物合成的bHLH转录因子报道。本研究在前期研究基础上，克隆了一个调控苦荞黄酮化合物生物合成的候选基因FtbHLH3，对其进行了生物信息学、转录特性、亚细胞定位、基因共表达、基因表达量与总黄酮含量间相关性等方面的分析和研究。

3.1 FtbHLH3是不具有转录激活活性bHLH转录因子家族成员

bHLH转录因子是植物中第二大转录因子家族，其家族所有成员的蛋白序列中均含有一个保守的bHLH结构域［3,7-8]。本研究利用RT-PCR方法从苦荞品种‘黑苦013’中克隆了前期研究鉴定的调控苦荞黄酮化合物生物合成的候选bHLH转录因子基因FtbHLH3。蛋白序列保守结构域和亚细胞定位分析显示，FtbHLH3含有bHLH转录因子家族的保守结构域［3,7-8]，其蛋白亚细胞定位于细胞核，具有典型的转录因子亚细胞定位特性，表明其是一个bHLH转录因子家族成员。FtbHLH3的转录激活活性分析表明，其不具有转录激活活性，暗示其可能通过与其他具有转录激活作用的转录因子互作来调控下游靶基因表达。

3.2 FtbHLH3可能是植物中调控类黄酮生物合成的全新bHLH转录因子

植物bHLH转录因子在类黄酮生物合成中具有极其重要的调控作用［3-4]。目前已报道的调控类黄酮生物合成的bHLH转录因子主要通过调控类黄酮生物合成结构基因表达来调控类黄酮生物合成，如玉米ZmR［5]和ZmIn1［16]、杨梅MrbHLH1［17]、萝卜RsTT8［8]、钝鳞紫背苔PabHLH1［10]和梨PpbHLH64［14]已被功能和生化实验证实通过直接调控黄酮化合物生物合成结构基因CHS、CHI、F3H、F3'H、ANS、ARN、DFR、LAR和UFGT的表达来调控黄酮化合物的生物合成。在本研究中，利用公共可用的转录组数据进行基因共表达分析发现，FtbHLH3与调控拟南芥黄酮化合物生物合成的关键bHLH转录因子基因TT8的同源基因FtTT8和12个类黄酮生物合成结构基因（3个CHS、1个CHI、2个F3H、2个F3'H、1个ANS、1个ANR、1个DFR和1个LAR）共表达。RT-qPCR分析显示，FtbHLH3在苦荞不同组织部位中的表达模式与来自转录组数据的表达模式高度相似。此外，FtbHLH3在不同组织部位中的表达量与总黄酮含量间的相关性分析显示，其表达量与总黄酮含量间存在极高的正相关性。这表明，FtbHLH3是苦荞中一个重要的黄酮化合物生物合成调控基因，其可能通过正调控黄酮化合物生物合成结构基因的表达来正调控黄酮化合物的生物合成。

在植物中，目前已鉴定的调控黄酮化合物生物合成的bHLH转录因子，除羊草LcbHLH92［15]和梨PpbHLH64［14]外，均属植物bHLH转录因子家族的IIIf亚家族成员［18]。本研究中，系统进化分析显示，FtbHLH3与已知的调控黄酮化合物生物合成的bHLH转录因子IIIf亚家族和IVd亚家族成员不聚为一支，暗示其可能是植物中一个调控黄酮化合物生物合成的全新bHLH转录因子。在植物中，大多数调控黄酮化合物生物合成的bHLH转录因子需要与MYB转录因子互作来调控黄酮化合物的生物合成［6-15]。本研究中，FtbHLH3的蛋白结构域分析显示，其不含有与MYB蛋白互作的结构域。此外，转录激活活性分析结果显示，FtbHLH3不具有转录激活活性。这些结果表明，FtbHLH3可能通过与其他类型的转录因子互作来调控苦荞黄酮化合物的生物合成。然而，有关FtbHLH3的功能及调控黄酮化合物生物合成的分子机制有待进一步研究。

4 结论

FtbHLH3是一个非IIIf亚家族bHLH转录因子成员，其编码蛋白定位于细胞核、不具有转录激活活性，其可能通过与非MYB转录因子互作来调控苦荞黄酮化合物生物合成结构基因的表达来调控黄酮化合物的生物合成。