代谢工程改造毕赤酵母生产赤藓糖醇

赵思佳 王晓璐 孙纪录 田健 张杰

（1. 河北农业大学食品科技学院，保定 071000；2. 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所动物营养学国家重点实验室，北京 100193）

赤藓糖醇（erythritol）在自然界中分布广泛，是一种天然甜味剂、渗透保护剂。它存在于梨、葡萄等水果，蘑菇、甜菜等蔬菜，啤酒、清酒等饮料，酱油等发酵食品，海藻以及人和动物体液中［1]。赤藓糖醇的口感、质地与蔗糖相似，甜度为蔗糖的60%-80%，热量仅为蔗糖的5%，在多元醇中对动物机体的副作用最小［2-4]。赤藓糖醇能被小肠快速吸收，但90%不参与人体代谢，且与尿液一起排出体外，不改变体内血糖和胰岛素水平，被认为是一种零热量、安全性高的甜味剂，受到了糖尿病患者和减肥人群的青睐。除了作为功能性甜味剂外，赤藓糖醇还有一定的抗氧化特性，可作为自由基清除剂［5]。此外，它还具有保护肝脏、吸湿性低、热稳定性好、溶解热低、耐受量高、防龋齿、加工特性优良等特点［6]。目前，赤藓糖醇被广泛应用于食品、医药、化工及化妆品等领域，用于制作牙膏、无糖食品、饮品、保健品以及药品［7]。据预测，2023年全球赤藓糖醇的年产值可达1.5亿美元，相比2017年提升了1.9倍［8]。

天然的蔬菜、水果中赤藓糖醇的含量太低，直接提取的成本较高，故赤藓糖醇的生产方法主要是化学合成法和微生物发酵法［9]。化学合成法包括用金属或金属氧化物催化、用阿拉伯酸或核糖酸电解脱羧等方法，但这些反应过程需要高温、高压，生产成本高昂［10]。微生物发酵法主要是用真菌进行发酵生产赤藓糖醇，此外一些细菌如酒球菌（Oenococcus oeni）、明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）、旧金山乳杆菌（Lactobacillus sanfranciscensis）等也可以生产少量赤藓糖醇［11-13]。目前，被用于生产赤藓糖醇的菌属有：耶氏酵母属（Yarrowia）、假丝酵母属（Candida）、圆酵母属（Torula）、假酵母属（Pseudozyma）、丛梗孢酵母属（Moniliella）等［14]。常用的酵母菌包括丛梗孢酵母（Moniliella pollinis）、解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）、球头三型孢菌（Trichosporonoides oedocephalis）等［15]。基于M.pollinis细胞裂解物的培养基可以使乙醇转化为赤藓糖醇，从而提高赤藓糖醇总产量，在甘蔗汁补料分批发酵M. pollinis时，获得了最大滴度为94.9 g/L的赤藓糖醇［16]。以粗甘油为原料、Y. lipolytica野生型为底盘菌株，探究提高赤藓糖醇产量的方法，研究发现单独过表达GUT1的突变株GUT1表达量可以提高11倍，由于基因的协调作用，同时，过表达GUT1、GUT2粗甘油同化可以提高1/3。过表达TKL1的菌株赤藓糖醇效价比对照菌株增加了48.1%，说明编码转酮醇酶的TKL1对于赤藓糖醇的合成起了重要作用。过表达GUT1、GUT2和TKL1，敲除EYD1是生产赤藓糖醇的最佳组合，根据此组合获得的突变株Y-11在5 L生物反应器中赤藓糖醇产量达到了150 g/L［17]。以T. oedocephalis为底盘菌株，敲除HOG1后在200 g/L葡萄糖和0.3%柠檬酸条件下发酵120 h，得到（69.12±0.19）g/L赤藓糖醇，但当柠檬酸浓度增加到0.4%时，赤藓糖醇的产量降低，说明较高浓度的柠檬酸可能会抑制细胞生长并影响代谢［18]。

甲基营养酵母毕赤酵母（Pichia pastoris）易于遗传操作、在葡萄糖和甘油上能够快速生长、可以高细胞密度发酵以及在细胞内、外产生高水平异源蛋白质的能力使它成为一种有吸引力的多功能底盘细胞［19]。近年来，P. pastoris已被广泛用作生产各种高价值生物活性化合物的高效细胞工厂，包括苹果酸［20]、脂肪酸［21]、肌醇［22]等。P. pastoris作为一种耐高渗酵母菌，具有高产赤藓糖醇的潜力，但目前还没有赤藓糖醇在P. pastoris中合成的相关报道。

本研究以P. pastoris GS115为出发菌株构建赤藓糖醇细胞工厂，分析糖酵解途径、戊糖磷酸途径碳代谢流改造及4-磷酸赤藓糖磷酸化酶、糖醇磷酸酶、赤藓糖还原酶的过表达对P. pastoris中赤藓糖醇生产的影响，同时利用生物信息学结合代谢工程技术研究副产物阿拉伯糖醇和核糖醇合成关键基因，为高产赤藓糖醇P. pastoris工程菌株构建奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

所用菌株及质粒见附表1。所用引物均由擎科生物合成（附表2）。

表2 突变株C5高密度发酵产物Table 2 Products of high-density fermentation of mutant C5

1.2 方法

1.2.1 基因组编辑载体的构建 为了构建生产赤藓糖醇的P. pastoris菌株，并提高其产量，试验弱化了P. pastoris自身的果糖-6-磷酸激酶I基因pfk1、甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因（PAS_chr2-1_0437）；敲除了果糖-6-磷酸激酶II基因pfk2，合成阿拉伯糖醇和核糖醇的基因PAS_chr2-2_0019、PAS_chr4_0988、PAS_chr4_0754和PAS_chr1-1_0490；过表达自身转酮酶基因TKL1（PAS_chr1-4_0150），来源于酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的核酮糖-3-磷酸差向异构酶基因rpe1和去磷酸化酶基因pyp1，来源于E. coli的去磷酸化酶基因yidA，来源于里氏木霉（Trichoderma reesei）的赤藓糖还原酶基因err1，来源于Y. lipolytica的NADH依赖型以及木兰假丝酵母（Candida magnoliae）的NADPH依赖型赤藓糖还原酶基因er，经过组合，共构建了7个基因组编辑质粒（附表1）。

P. pastoris基因组编辑质粒的构建参照前期已经建立的方法［22]。以重组质粒p19-3-1-Δaox-Pgap1-pyp1的构建为例：以P. pastoris GS115基因组为模板，扩增aox两侧各1000 bp左右的DNA序列作为上下游同源臂，将上游同源臂与p19-3-1质粒连接，通过PCR及overlap PCR获得small arm-Pgap1-pyp1-down arm片段，利用同源重组试剂盒将该片段与p19-3-1-up-arm质粒连接，即获得p19-3-1-Δaox-Pgap1-pyp1重组质粒。其他基因组编辑质粒的构建与之类似，不再赘述。

1.2.2 重组毕赤酵母菌株的构建 共构建11个重组P. pastoris菌株。P. pastoris工程菌构建分为两部分：目的片段的敲入和抗性基因的敲除。构建方法参考文献［22]，简述如下：

目的片段的敲入。利用限制性内切酶Not I酶切载体，将线性化的重组质粒转化P. pastoris菌株，经30℃、30 min复苏后，将转化后的菌液涂布于含Zeocin抗性的BMGY培养基，30℃倒置培养48 h。待单克隆出现后，利用克隆PCR和测序的方法验证目的片段的敲入情况。

抗性基因的敲除。选取成功整合目的片段的菌株进行甲醇诱导，通过mazF毒性基因的表达结合同源重组将抗性标签敲除。甲醇诱导体系：5 mL YNB、45 mL ddH2O和500 μL甲醇。30℃诱导，每24 h补加500 μL甲醇。诱导2-3 d后的菌液梯度稀释涂布BMGY培养基，利用克隆PCR和测序的方法验证抗性标签的去除情况。

1.2.3 外源基因在毕赤酵母中的表达 为了快速筛选外源基因，采用构建游离质粒，电转化P. pastoris的方法，验证外源基因是否表达。基础表达质粒T-ARS-PGAP是在T载体的基础上构建，含有能在P. pastoris中自我复制的ARS（autonomously replicating sequence）复制子，组成型强启动子PGAP，用于纯化的His标签，Ampicillin、Zeocin抗性标记以及预留的多个酶切位点。筛选的目的基因包括来源于S. cerevisiae的pyp1，来源于T. reesei的err1，来源于Y. lipolytica的er（NADH）、ER10、ER25和JX885，来源于C. magnoliae的er（NADPH），来源于M. megachiliensis的er1、er3，经密码子优化后，由北京六合华大基因科技有限公司合成。yidA和rpe1分别以E. coli和S. cerevisiae的基因组为模板扩增获得。目的基因删除终止密码子，经过PCR扩增后，利用同源重组试剂盒连接到T-ARS-PGAP载体的Hind III和Xho I酶切位点，获得这些基因的表达载体（附表1）。

将含有目的基因的表达载体转化P. pastoris C0菌株，挑取单克隆转化子，30℃培养24 h。选择生长旺盛的菌株接种于50 mL BMGY培养基培养24 h，然后，按2%接种量转接于200 mL BMGY培养基，30℃、200 r/min培养48 h。将菌液于5000 r/min离心，获得菌体，经液氮研磨，用10 mL Tris-HCl（pH 7.4）重悬，12000 r/min离心10 min，取上清。含His标签的蛋白通过磁珠法纯化（His-tag蛋白纯化磁珠，海狸公司），进行SDS-PAGE检测。

1.2.4 摇瓶发酵与高密度发酵 挑取正确的单克隆接种于50 mL BMGY生长培养基中，30℃培养48 h，制作发酵种子液。摇瓶发酵在含有200 mL低盐发酵培养基的锥形三角瓶（1 L）中进行，培养温度30℃，摇床转速200 r/min，每个菌株设置3个平行。高密度发酵在含有7 L低盐发酵培养基的发酵罐（10 L）中进行，温度30℃，溶氧量30%，菌株生长前期以甘油为碳源，控制pH 4.5。当细胞湿重达到180-200 mg/mL时，碳源换为葡萄糖，将菌株的状态由生长转换为生产。

1.2.5 产物含量的检测 采用高效液相色谱法（HPLC）检测发酵液中的赤藓糖醇、葡萄糖、阿拉伯糖醇、核糖醇等化合物的含量。1 mL发酵液经12000 r/min离心3 min，用0.22 μm滤器过滤上清，取200 μL置于内插管中，4℃保存待测。检测仪器为示差折光检测器，色谱柱型号Agilent Hi-Plex Ca（7.7 mm×300 mm，8 μm），流动相为超纯水，流速为0.5 mL/min，柱温80℃。

2 结果

2.1 弱化糖酵解途径

细胞从外界吸收葡萄糖，经过磷酸化生成葡萄糖-6-磷酸，其中一部分进入戊糖磷酸途径，另一部分进入糖酵解途径进行代谢。为了使更多的葡萄糖-6-磷酸进入戊糖磷酸途径，进而流向赤藓糖醇的前体物质——赤藓糖-4-磷酸，试验首先对糖酵解途径进行了弱化。进入糖酵解途径的葡萄糖-6-磷酸被葡萄糖-6-磷酸异构酶异构化生成果糖-6-磷酸，果糖-6-磷酸在磷酸果糖激酶作用下生成果糖-1,6-磷酸，随后，在醛缩酶的作用下生成甘油醛-3-磷酸（图1）。已知P. pastoris中起作用的磷酸果糖激酶有磷酸果糖激酶I（PFK1,GenBank：PAS_chr2-1_0402）和磷酸果糖激酶II（PFK2,GenBank：PAS_chr2-1_0047）。

图1 毕赤酵母中赤藓糖醇合成通路的构建Fig. 1 Construction of erythritol biosynthetic pathway in P. pastoris

据报道，pfk1、pfk2在P. pastoris中均可实现单独敲除，但不能同时敲除，不论敲除顺序如何，均不能得到pfk1、pfk2双敲菌株，因此，选择在pfk2敲除的菌株P. pastoris C1中弱化pfk1。在P. pastoris中，甘油的利用受到葡萄糖的抑制，而抑制作用主要是由于甘油代谢的第一步基因——甘油激酶基因（gut1）的表达受到调控所致。因此，选择利用甘油激酶基因的启动子Pgut1替换了C1菌株中pfk1的启动子，以期利用碳代谢抑制（carbon catabolite repression，CCR）的原理调控糖酵解的代谢流，成功获得菌株P. pastoris C2。

对获得的突变株P. pastoris C2及对照菌株C0进行摇瓶发酵。菌株首先利用发酵培养基中的甘油为唯一碳源生长24 h，之后补加50 g/L葡萄糖继续发酵。由图2-A可以看出，2株菌在前24 h生长基本一致，说明以甘油为碳源时，C2菌株的Pgut1-pfk1正常表达。在培养基中补加葡萄糖后，C2的生长明显慢于对照菌株C0，发酵72 h时，C2的OD600仅为C0的2/3。由此可见，敲除pfk2并用Pgut1控制pfk1的表达，以葡萄糖为碳源时减弱了C2的糖酵解途径，抑制了菌株生长。同时，发酵结果显示，菌株C2在摇瓶发酵过程中产生了副产物——阿拉伯糖醇和核糖醇（图2-B）。2个副产物均来自戊糖磷酸途径，说明C2的戊糖磷酸途径的代谢流得到加强。但副产物的产生会影响目标产物的生产，并对目标产物的分离纯化造成困扰，因此，消除和降低副产物也是本研究的重要内容。

图2 毕赤酵母菌株C0和C2的表型验证Fig. 2 Phenotype verification of P. pastoris C0 andC2 strains

2.2 副产物合成关键基因的敲除

根据摇瓶发酵结果，已知C2菌株发酵过程中的主要副产物为阿拉伯糖醇和核糖醇。通过KEGG、NCBI等数据库分析发现，与这两个副产物合成相关的糖醇脱氢酶基因主要有3个：0019（GenBank：PAS_chr2-2_0019）、0754（GenBank：PAS_chr4_0754）和0988（GenBank：PAS_chr4_0988）。其中，0754和0988在P. pastoris基因组上的位置相近。通过同源重组的方法将3个基因依次敲除，得到突变株P. pastoris C3（Δ0019）和C4（Δ0019Δ0988Δ0754）。

对C3和C4突变株进行摇瓶发酵。结果（图3）显示，敲除0019使C3的核糖醇产量相比C2降低了58.6%。由于核糖醇和阿拉伯糖醇来自于同一个前体物核酮糖-5-磷酸，因此C3的阿拉伯糖醇产量有所升高。进一步敲除0988和0754后，C4的阿拉伯糖醇产量相比C2降低了95.6%，而对应的核糖醇产量有所提升。由此可见，0019主要催化核糖醇的生产，而0988和0754主要介导阿拉伯糖醇的生产。C3和C4突变株的副产物总产量（阿拉伯糖醇和核糖醇之和）分别为5.6和1.9 g/L，相比C2菌株（6.2 g/L）分别降低了6.7%和69.4%。

图3 毕赤酵母菌株C2、C3、C4阿拉伯糖醇和核糖醇的生产Fig. 3 Production of arabitol and ribitol by P. pastoris C2,C3 and C4 strains

2.3 构建赤藓糖醇合成通路

赤藓糖醇合成的前体物是来自戊糖磷酸途径的赤藓糖-4-磷酸。在真菌中，赤藓糖-4-磷酸首先去磷酸化生成赤藓糖，然后在赤藓糖还原酶的作用下还原成赤藓糖醇。在细菌中，赤藓糖-4-磷酸则先被赤藓糖醇-4-磷酸脱氢酶还原成赤藓糖醇-4-磷酸，再通过磷酸酶作用生成赤藓糖醇。本研究选择前一条通路，在P. pastoris中构建赤藓糖醇合成途径。

2.3.1 赤藓糖还原酶基因的筛选与外源基因的表达 选取不同来源的赤藓糖还原酶基因（表1）［23-25]。将选取的赤藓糖还原酶基因以及本研究中所涉及的其他外源基因与含有His标签的过表达载体连接（图4-A），并转入P. pastoris验证其表达情况。结果显示，4-磷酸赤藓糖磷酸化酶基因yida，赤藓糖还原酶基因err1、er（NADH）和er1，糖醇磷酸酶基因pyp1及磷酸核酮糖差向异构酶基因rpe1能在P. pastoris中表达（图4-B），因此，选择这些基因在P. pastoris中构建赤藓糖醇合成通路。

图4 外源基因在毕赤酵母中表达Fig. 4 Expressions of exogenous genes in P. pastoris

2.3.2 构建毕赤酵母赤藓糖醇合成通路 首先在P. pastoris中敲入赤藓糖还原酶基因，即过表达Y.lipolytica来源的依赖于NADH的赤藓糖还原酶基因er（NADH），探究在P. pastoris自身含有的磷酸酶基因以及敲入的赤藓糖还原酶基因的作用下能否生产赤藓糖醇。

经过基因组编辑，在C4菌株中整合了PGAP-er（NADH）表达框获得菌株C5。高密度发酵结果显示，C5突变株的发酵液中没有赤藓糖醇的积累（表2）。猜测可能有两个原因造成了这个现象：（1）前体物赤藓糖-4-磷酸供给不足；（2）P. pastoris自身的磷酸酶不能将赤藓糖-4-磷酸转化成赤藓糖，需要表达外源磷酸酶基因。因此，选择对糖酵解中的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因（GAPD，GenBank：PAS_hr2-1_0437）进行弱化，使更多的碳代谢流留在戊糖磷酸途径。

将C4菌株的GAPD启动子替换成Pgut1启动子，获得菌株C6。S. cerevisiae来源的糖醇磷酸酶PYP1可以催化赤藓糖醇-4-磷酸水解为赤藓糖醇，因此，在菌株C6中过表达经密码子优化后的pyp1，获得菌株C7。然而，结果显示，突变株C7并没有获得生产赤藓糖醇的能力。在过表达pyp1的基础上，选择再整合表达来源于E. coli的4-磷酸赤藓糖磷酸化酶基因yidA，构建了菌株C8。结果显示，C8突变株的生物量相比出发菌株有一定的降低（图5-A），发酵液中生产了约30 mg/L的赤藓糖醇（图5-B）。另外，副产物阿拉伯糖醇和核糖醇也有一定的积累图5-C）。

图5 毕赤酵母菌株C0和C8的表型验证Fig. 5 Fermentation profiles of P. pastoris C0 and C8 strains

2.4 强化戊糖磷酸途径

在Y. lipolytica中，过表达戊糖磷酸途径关键酶转酮酶基因TKL可以提高赤藓糖醇的生产［26]。并且根据KEGG数据库分析，P. pastoris GS115菌株中缺少磷酸核酮糖差向异构酶基因rpe。因此，选择过表达S. cerevisiae来源的rpe1以及P. pastoris自身的转酮酶基因TKL1（PAS_chr1-4_0150），使更多的葡萄糖-6-磷酸流向赤藓糖醇的前体物质——赤藓糖-4-磷酸，从而达到提高赤藓糖醇产量的目的。

在过表达pyp1和yidA菌株的基础上，又整合了PGAP-rpe1和PGAP-TKL1表达框，构建了菌株C10。摇瓶发酵结果由图6所示，菌株C0与C10的生长接近，C10的赤藓糖醇产量达到1.2 g/L，相比C8提高了约40倍。C10的发酵液中并没有检测到阿拉伯糖醇的生产，但核糖醇达到10.0 g/L，相比C8也大幅提升。

图6 毕赤酵母菌株C0和C10的表型验证Fig. 6 Phenotype verification of P. pastoris C0 and C10 strains

摇瓶发酵由于不能控制溶氧和pH，无法真正反映菌株的生产潜力，因此，使用10 L发酵罐对C10菌株进行了高密度发酵。发酵初期以甘油为碳源，待菌体生长至湿重约180 mg/mL后流加70%葡萄糖进行补料发酵，流加葡萄糖72 h后发酵结束。HPLC分析结果（图7）显示，突变菌株C10赤藓糖醇产量为10.6 g/L，副产物阿拉伯糖醇7.5 g/L，核糖醇8.7 g/L。

图7 毕赤酵母菌株C10高密度发酵Fig. 7 High-cell-density fermentation with strain P. pastoris C10

2.5 过表达赤藓糖还原酶对赤藓糖醇产量的影响

赤藓糖还原酶可催化赤藓糖生成赤藓糖醇，是赤藓糖醇合成途径的最后一步催化酶，其活性对赤藓糖醇的生产尤为关键。根据不同来源的赤藓糖还原酶在P. pastoris中的表达情况（图4-B），选择来源于Y. lipolytica的依赖于NADH的er（NADH）和来源于T. reesei的依赖于NADPH的err1进行过表达［27-28]。2个基因使用PGAP作为启动子整合到了C10菌株的基因组上，分别得到突变株C11（PGAPerr1）和C12（PGAP-er（NADH））。对C11、C12菌株进行摇瓶发酵（表3）。C11和C12的赤藓糖醇产量均为1.2 g/L，与C10的摇瓶发酵产量一致。C10菌株在摇瓶发酵中没有检测到阿拉伯糖醇，而C11和C12的阿拉伯糖醇产量分别达到4.9和5.1 g/L，说明过表达的2个还原酶对核酮糖底物也可能具有一定的还原活性，因此，造成了阿拉伯糖醇产量的提升。

表3 突变株C11和C12摇瓶发酵产物Table 3 Products of shake-flask fermentation of mutant C11 and C12

对副产物含量较少的菌株C11进行了高密度发酵（图8）。C11高密度发酵的湿重最高可达320.0 mg/mL，赤藓糖醇在发酵过程中一直积累，发酵结束时产量仅为2.1 g/L，相比C10的高密度发酵有较大幅度的降低。副产物阿拉伯糖醇和核糖醇产量达到了17.9和18.5 g/L，相比C10的高密度发酵有很大程度的提高，再次说明在P. pastoris中过表达赤藓糖还原酶对赤藓糖醇的生产具有负面作用。

图8 毕赤酵母菌株C11高密度发酵Fig. 8 High-cell-density fermentation with strain P. pastoris C11

3 讨论

在过去的几十年里，P. pastoris已经进行了许多成功的糖基化研究，使这种甲基营养酵母成为最常用的蛋白质，特别是人源蛋白质表达酵母宿主之一［29]。P. pastoris已被用于在工业水平上生产各种重组蛋白产品，包括微生物蛋白、酶和生物制药蛋白［30]。近期，它被报道用于合成高价值的生物活性物质。在P. pastoris中融合表达LevB1、SacB两个酶，1.5 L生物反应器水平下，从160 g蔗糖可以获得72.9 g不含单糖的Levan型低聚果糖［31]。应用糖基磷脂酰肌醇锚定系统，将β-葡萄糖苷酶BGL、内切葡聚糖酶EG、纤维二糖水解酶CBH共同展示在P. pastoris表面，结合SPI1启动子和分泌信号序列进一步增强细胞表面纤维素酶活性，获得能将磷酸溶胀纤维素水解为葡萄糖的P. pastoris菌株，在此基础上表达丙酮酸裂解酶UbiC，进行96 h分批发酵，该菌株从磷酸溶胀纤维素产生了975 mg/L 4-羟基苯甲酸，产量比以葡萄糖为底物高2倍以上［32]。通过联合过表达ZWF1和SOL3提高NADPH供应，过表达腺嘌呤磷酸核糖转移酶增强AMP供应，低强度表达NADH激酶POS5，敲除NADH依赖性二羟基丙酮磷酸还原酶得到P. pastoris X33-38菌株。经过72 h摇瓶发酵产生了3.09 g/L α-法尼烯，产量比出发菌株高41.7%［33]。近几年研究表明，P. pastoris是性状优良的高价值生物活性物质生产平台。

P. pastoris的众多优势是选择它作为生产赤藓糖醇的宿主细胞的原因，但在本研究开展的过程中也发现以该菌株作为底盘细胞生产高价值化合物时存在一些缺点，特别是应用代谢工程的方法改造P.pastoris生产赤藓糖醇的过程中，伴随着大量副产物的产生。P. pastoris是耐渗透酵母，当培养环境中糖浓度较高时，会通过产生一些物质维持渗透压平衡。经过弱化糖酵解途径，增加戊糖磷酸途径的碳流量，发酵产物中出现了副产物阿拉伯糖醇和核糖醇。根据之前的报道，包括核糖醇和阿拉伯糖醇在内的一些糖醇化合物是酵母菌的渗透调节剂［14]。通过调节细胞渗透压，向培养基中添加一定量的NaCl能够将Y. lipolytica的副产物甘露醇和阿拉伯糖醇分别减少46%和30%［17]，也可以说明产生渗透调节剂是酵母菌的应激反应。尽可能地敲除副产物合成途径且不产生新的副产物是代谢工程改造菌株研究中的一个重要部分。本研究选择了产生核糖醇和阿拉伯糖醇的关键基因并对其进行敲除，副产物产量明显下降，且没有新的副产物生成。戊糖磷酸途径中关键酶的活性对赤藓糖醇的生产至关重要，核糖醇和阿拉伯糖醇等副产物的产生也说明P. pastoris中核酮糖-5-磷酸的转化受到了一定的限制。因此，本研究选择过表达S. cerevisiae来源的3-磷酸核酮糖差向异构酶rpe1以及转酮醇酶TKL1，使更多的碳源流向产物。根据先前的报道，来源于Y. lipolytica和T. reesei的赤藓糖还原酶对赤藓糖具有较高的催化活性，但同时对其他底物，如阿拉伯糖、果糖等也有一定的活性［27-28]，而且不同来源的赤藓糖还原酶的底物特异性也有所不同。本研究选择过表达这两个酶进一步提高赤藓糖醇产量，但是结果显示赤藓糖醇的合成并未提升，反而造成了阿拉伯糖醇产量的提高，因此，推测这两个酶可能对核酮糖也有一定还原活性，后续研究将对具有专一性的赤藓糖还原酶进行探索。传统的发酵方法是利用游离的菌体通过发酵获得产品，有研究将细胞固定化的方法应用到生产赤藓糖醇中，通过将底盘细胞M. pollinis固定在2 L生物反应器内，96 h生产了47.03 g/L赤藓糖醇，实现了细胞固定化生产赤藓糖醇［34]。在后续的工作中可以尝试将此方法用于P. pastoris或其他酵母菌株来生产赤藓糖醇以及更有价值的化合物。

4 结论

以P. pastoris为底盘细胞构建了赤藓糖醇合成通路，弱化糖酵解途径关键基因，敲除阿拉伯糖醇和核糖醇等副产物生产相关基因，过表达糖醇磷酸酶和4-磷酸赤藓糖磷酸化酶基因有利于赤藓糖醇的生产。强化戊糖磷酸途径关键酶转酮酶和磷酸核酮糖差向异构酶的表达，大幅提高了赤藓糖醇的产量。最优菌株在摇瓶和高密度发酵中赤藓糖醇的产量分别达到1.2和10.6 g/L。

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