基因编辑技术改良玉米株型增加杂交种产量

石佳鑫 刘凯 朱金洁 祁显涛 谢传晓 刘昌林

（1. 中国农业科学院作物科学研究所，北京 100081；2. 四川农业大学玉米研究所，成都 611130）

玉米（Zea mays L.）是遍布世界的重要农作物之一。我国的玉米种植面积大，产量占比超过粮食总产量的40%，对保障我国的粮食安全至关重要［1]。作为天然的C4植物，玉米具有更高的光合潜力［2]。如何更好地发挥玉米的光合潜力，提高玉米产量是当下研究的热点之一。国内外研究表明，密植能够通过改善玉米群体冠层结构，协调单株与群体关系而有效地增加玉米单位面积的产量［3-5]。玉米群体的种植密度能否增加，受限于玉米株型结构分布是否理想［6]，超过适宜密度的栽培措施会造成玉米倒伏、空杆和秃尖增长等负面性状出现［7-8]，最终影响产量。因此创制株型结构分布合理的“理想株型”玉米，能够通过增加栽培密度的上限实现增产。玉米的“理想株型”表现为上部叶片紧凑、节间长，且穗上平均叶面积指数较大等［6]。从个体来看，叶夹角小且紧凑的“理想株型”玉米，由于整株能够更加均匀的接受光照，在高水平的光合光子通量密度下，其截获辐照度的利用效率更高［9]；从群体来看，“理想株型”玉米能通过优化单株光合效率、穗三叶的叶向值与有效光合面积等方面提高光能利用率而促进干物质积累和转运，最终提高产量［10-11]。为创制“理想株型”玉米，可通过杂交育种的方式对玉米双亲选择和组配。玉米株型相关性状的研究表明，在不同背景的杂交组合中，杂交种的叶夹角与双亲的叶夹角显著正相关［12]。选择叶夹角适当的亲本能够通过杂种优势创制株型和产量优于双亲的F1植株。例如在油菜中，Li等［13]利用生长素信号基因BnaA3.IAA7配制杂合型突变体，获得株型改良的杂交种，实现油菜的密植增产。传统方法通过回交改良杂种亲本，这一过程在导入目标位点时，因为连锁累赘引入非目标性状［14]。为解决这一难题，基因编辑技术精确地靶向目的基因能够打破基因连锁，创制基因精确编辑的突变材料，这种策略被称为DTM（desire targeted mutation）策略［15]。通过这种策略突变叶夹角大小调控基因，精确的改变玉米株型在理论上是可能的。在叶夹角的众多调控基因中，ZmLG1（Zm00001d002005）可能通过参与叶发育早期叶片-叶鞘边界线的形成，影响叶耳和叶舌的发育［16]调控叶夹角的大小。研究发现天然的Zmlg1隐性突变体表现为叶耳和叶舌的缺失，致使植株叶夹角减小。该基因的调控模式，先后在玉米［17]、水稻［18]、小麦［19]、大麦［20]等作物中被发现，说明LG1基因在作物中的功能具有保守性。对不同物种LG1结构域的研究表明，该基因涉及的调控通路可能仅影响叶夹角和抗逆响应，而不参与到花期等其他性状的调控过程［21]，对叶夹角无关性状影响较小。因此选取ZmLG1基因作为靶标，更倾向于获得精准减小叶夹角的植株。考虑到玉米Zmlg1纯合突变有影响散粉的潜在风险［22]，本研究编辑Zmlg1获得Zmlg1纯合基因型的母本，再与相应的父本杂交获得ZmLG1Zmlg1型的杂交种。通过观察分析，选择抗性较好且无明显缺陷的中单88母本自交系CX1为改良对象。本研究以改良母本CX1为设计出发点开展了相关实验。将ZmLG1编辑为Zmlg1的CX1命名为CX1-lg1，评估了其制种效率，并配制基因型为ZmLG1Zmlg1的改良杂交种中单88M开展多环境下增密栽培试验，评估了Zmlg1基因的应用价值，也对基因编辑技术在杂交育种中的应用进行了探索。

1 材料与方法

1.1 材料

本次试验所用编辑诱导材料CF13-1［15]由中国农业科学院作物科学研究所玉米基因编辑育种创新研究组提供，以改良材料中单88M和其母本CX1-lg1为试验材料，未改良中单88和其母本CX1为对照。

1.2 方法

1.2.1 改良母本CX1-lg1和中单88M的创制 分析亲本自交系CX1的ZmLG1序列，挑选符合CRISPR/Cas9系统的sgRNA序列，构建编辑载体遗传转化，获得ZmLG1的编辑诱导材料CF13-1［15]。将CX1与CF13-1杂交，对F1进行Cas9元件的PCR检测，所用引物为Cas9JC-F（5'-AGCTGGTTGTAGGTCTGCAC-3'）和Cas9JC-R（5'-TTCAAGGTGCTGGGCAAC-3'）。挑选编辑元件阳性个体，用于回交。以后每一代以此方法挑选Cas9元件阳性材料作为回交中间材料，作为父本，CX1为母本回交四代，获得BC4F1代材料。对BC4F1个体以相同的方式检测，挑选编辑元件阴性个体自交获得BC4F2，从中挑选到完全无叶舌叶耳个体3株，Sanger测序检测ZmLG1靶点突变情况，所用引物为LG1-F（5'-GCGTGGGAAGATGATGAACC-3'）和LG1-R（5'-GTACGTGTAGCCTCCTCTGG-3'）。3株材料均为同一类型编辑事件。我们将这一材料命名为CX1-lg1，对其扩繁并与CX2组配，获得改良的杂交种F1，命名为中单88M。

1.2.2 田间管理 播种前撒施底肥复合肥（N∶P∶K=18∶12∶10），用量600 kg/hm2。翻耕整地后采用双粒播种，确保出苗。株距为16-24 cm，行距为50 cm（顺义、通辽、南口）或60 cm（海南）。播种后次日进行镇压、灌溉；播种后3-4 d采用乙草胺作为封闭除草剂，每公顷用量2-2.5 kg。播种两周后统计出苗情况，对缺苗穴位补苗。玉米4-6叶期降苗，每穴留壮苗一株。苗期根据天气情况适当浇水，拔节后期到抽穗期注意保证充足水分。根据实际情况喷施除草剂或杀虫剂。拔节期追肥一次，采用高氮磷复合肥，用量为基肥的1/3。R6期以小区为单位收获。

1.2.3 制种试验设计 2020年在中国农业科学院海南南繁生物育种试验基地开展制种试验。试验采用完全随机设计，设置株距为24 cm，行距为50 cm，4 m为一行。制种行配比为母本∶父本=4∶1，5行为一组，每6个组为单个小区重复，共设计两个小区重复。其中，CX1（母本）与CX2（父本）组配获得杂交种中单88，CX1-lg1（母本）与CX2（父本）组配获得杂交种中单88M。田间管理增加母本人工去雄的操作，在拔节末期和抽穗前期进行。

1.2.4 改良杂交种密度试验设计 试验采用随机区组设计，以改良杂交种中单88M为材料，中单88为对照，安排5000、6000、7000株/667 m23个密度水平，每个小区为4 m×48 m，两组重复。2021年在通辽试验基地和中国农业科学院作物科学研究所顺义试验基地，2022年在中国农业科学院南口中试基地，3个环境条件下开展试验。

1.2.5 表型测定 株高和穗位高用塔尺（量程0-300 cm，精确度1 cm）直接测量。叶夹角表型测量穗上叶夹角、穗位叶夹角、穗下叶夹角。其中，穗上叶夹角和穗下叶夹角是穗上和穗下三片叶的均值。通过测量叶片基部20 cm处叶中脉和茎秆距离（量程0.0-50.0 cm，精确度0.1 cm）的间接法换算为角度值。

穗数以小区为统计单元，计有效穗（籽粒数＞30粒）个数。含水量通过KETT牌谷物水分测量仪（型号PM8188A），测量3次取平均值，记为小区籽粒含水量。收获量为小区收获所有穗重，用电子秤称重（量程0.00-120.00 kg，精确度0.05 kg）。出籽率为小区脱粒前与脱粒后重量的比值，产量为小区以14%标准含水量折算每667 m2产量。秃尖长用游标卡尺（量程0.0-180.0 mm，精确度0.1 mm）测量。穗行数直接计数，行粒数每穗随机统计3行，取平均数。

1.2.6 数据与图形处理 通过IBMSPSS25对实验数据进行t检验和双因素方差分析，用R语言绘制统计图。

2 结果

2.1 改良母本CX1-lg1基因序列与表型分析

改良母本CX1-lg1具有明显的紧凑表型（图1-A）。靶点测序结果显示CX1-lg1为纯合“GTAG”四碱基缺失编辑类型（图1-B）。对叶夹角进行观测，CX1-lg1穗上（图1-C）、穗下（图1-D）叶夹角平均值分别为4.78°和11.73°，CX1穗上、穗下叶夹角平均值分别为15.84°和27.79°。统计分析表明CX1-lg1穗上（图1-E）、穗下（图1-F）叶夹角比CX1均极显著的减小。

图1 CX1 和 CX1-lg1基因型与株型Fig. 1 Plant and genotype of CX1 and CX1-lg1

2.2 改良母本CX1-lg1制种效率评估

为了进一步验证株型的改良是否影响杂交制种的效率，我们在5000株/667 m2的密度条件下对CX1-lg1制种情况进行评估（图2-A、B）。结果表明改良母本CX1-lg1的小区平均有效穗数和折算平均产量分别为355穗和425.93 kg，CX1的平均有效穗数和折算平均产量为321.5穗和407.05 kg。与CX1相比，CX1-lg1具有更多有效穗（图2-C）和更高产量（图2-D）。

图2 改良母本的杂交制种产量Fig. 2 Seed production yield of improved maternal parent

2.3 改良杂交种中单88M不同密度的株型表现

我们分别对南口、顺义、通辽3个环境中，不同密度水平下的杂交种进行株型观测发现，中单88M在这3个环境下都表现出更紧凑的株型（图3-A）。在南口5000、6000、7000株/667 m2水平下，中单88M穗上叶夹角平均值分别是21.35°、20.27°、20.98°，穗下叶夹角平均值分别是25.60°、25.63°、24.00°；对照中单88在5000、6000、7000株/667 m2三个密度水平下，穗上叶夹角平均值分别是26.39°、27.64°、27.13°，穗下叶夹角平均值分别是30.20°、30.47°、30.33°。在相应密度水平下，中单88M穗上和穗下叶夹角均比中单88极显著减小。顺义和通辽两个环境中情况类似，在不同栽培密度下，中单88M穗上（图3-B）和穗下（图3-C）叶夹角均小于中单88。

图3 改良母本使改良杂交种中单88M株型紧凑Fig. 3 Improved maternal parent grants a compact plant type for hybrid Zhongdan88M

2.4 改良杂交种中单88M不同密度下的产量表现

我们测量了南口、顺义、通辽3个环境条件下不同密度水平的杂交种产量（图4-A）。结果表明，在南口5000、6000、7000株/667 m2三个密度水平下，中单88M的平均折算亩产依次是592.10 kg、659.10 kg、689.10 kg，中单88的折算亩产依次是598.80 kg、704.60 kg、649.10 kg，中单88M在7000株/667 m2密度下增产（图4-B）。在顺义5000、6000、7000株/667 m2三个密度水平下，中单88M的平均折算亩产依次是689.80 kg、709.80 kg、787.50 kg，中单88的折算亩产依次是671.20 kg、696.70 kg、715.50 kg，前者在7000株/667 m2密度下增产最多（图4-B）。在通辽5000、6000、7000株/667 m2三个密度水平下，中单88M的平均折算亩产依次是781.50 kg、896.40 kg、790.10 kg，中单88的折算亩产依次是852.00 kg、853.00 kg、710.30 kg，前者在6000和7000株/667 m2密度下有增产效应（图4-B）。

图4 改良杂交种中单88M在增密栽培条件下产量增加Fig. 4 Improved hybrid Zhongdan88M grants an increased yield in dense-planting cultivation

2.5 株型和产量受密度、材料、环境及互作效应影响

对杂交种密度试验数据进行多因素方差分析，结果表明：（1）在叶夹角方面，穗上叶夹角、穗位叶夹角和穗下叶夹角在不同环境、材料之间F值均达到显著水平，说明叶夹角的大小受到环境和材料的影响。而在不同密度下，穗上叶夹角有极显著差异，穗位叶夹角有显著差异，穗下无显著差异，说明叶夹角不同层次受密度影响的情况不同，表现出从冠层到底层受到密度的影响逐渐减小。此外穗上叶夹角和穗下叶夹角在环境和材料互作下F值达到极显著水平，穗位叶夹角达到显著水平（表1）。方差分析表明，中单88M穗上叶夹角受环境影响较小；穗下叶夹角受环境材料互作影响较大。密度和材料的互作效应，仅影响穗上叶夹角的大小（表1），中单88M受到密度材料互作效应较小。（2）在产量方面，环境影响秃尖长、收获量、出籽率、有效穗数和产量等性状，且均达到极显著水平；密度极显著影响秃尖长、有效穗数，显著影响收获量；环境和材料互作效应极显著影响秃尖长和有效穗数（表2）。两种材料受环境材料互作效应影响不同：中单88M秃尖长、收获量、出籽率受环境材料互作效应影响比中单88大，有效穗数和产量比中单88受影响小；密度材料互作效应显著影响秃尖长（表2），中单88M受该互作效应影响较小。

表1 株型相关性状方差分析 F 统计量Table 1 F statistic analysis of variance for plant type related traits

表2 产量相关性状方差分析 F 统计量Table 2 F statistic analysis of variance for yield related traits

3 讨论

3.1 编辑ZmLG1基因对CX1株型与制种效率的影响

ZmLG1基因减小玉米叶夹角的作用是明确和显著的［17]，并且通过基因编辑技术编辑不同作物的LG1均有类似的表型［18-20]。借助于DTM策略，通过杂交的方式将基因编辑元件导入目标自交系是可以发挥功能的［15]。本次实验结果表明，我们获得的改良材料CX1-lg1比CX1具有更小的上部和下部叶夹角，株型更紧凑。并且CX1-lg1在5000株/667 m2的密度下，有更高的制种产量。

3.2 改良杂交种中单88M株型和产量的表现

前人研究证明，对亲本特定性状的改良能够通过遗传在杂种一代表现［23]。为此我们通过改良母本获得了ZmLG1Zmlg1的改良杂交种中单88M。在不同环境不同密度下，中单88M穗上与穗下叶夹角与对照中单88相比均显著的减小，表现为紧凑的株型。3个环境中，在7000株/667 m2的密度水平下，中单88M与对照中单88相比有更高的产量，在较低密度水平下，并没有明显变化规律。因此株型改良的杂交种比原先更适应密植栽培。

3.3 基因编辑结合杂交育种技术改良杂交种株型

综合来看，改良杂交种中单88M和其改良母本中单88M-lg1在株型上具有相似表现，其遗传规律符合前人对叶夹角遗传规律的解析［12,24]。我们的实验证明通过基因编辑精确的调控目标性状是可行的。结合传统的杂交育种，通过对亲本目标性状的改良，能够提升杂交种的表现，使其更好地发挥杂种优势。由于株型改良对作物增产的正向贡献［6]，未来创制理想株型的杂交种具有重要的现实意义。我们在改良叶夹角的过程中，对非目标性状倒伏也产生了影响，可能由于LG1基因参与调控的未知通路受到影响，改变了杂种中相关通路的相互作用，需要进一步研究。随着株高、叶夹角、根系、花序等株型形成相关基因的克隆和更具体的功能解析，借助于精确的基因编辑工具，我们可以编辑基因编码序列或调控元件的特定碱基，更精确地改变蛋白序列或更精细的调控表达，实现更精准的表型调控。

4 结论

通过基因编辑技术结合DTM策略成功改良了杂交种母本株型，提升其制种效率；并创制了株型紧凑的杂交种中单88M，不同栽培密度和试验环境与材料互作，但两种材料不同性状受材料密度和材料环境的两种互作效应影响的大小不同。综合比较认为，通过母本改良获得的杂交种中单88M能在高密度（7000株/667 m2）下实现增产。