LncRNA-MIAT通过抑制miR-519d-3p激活EZH2促进甲状腺癌的恶性行为

吾甫尔·依马尔, 王护国

(新疆医科大学第一附属医院血管甲状腺外科, 新疆 乌鲁木齐 830054)

甲状腺癌(thyroid cancer,THCA)是最常见的内分泌恶性肿瘤之一,近30年来其发病率持续上升[1]。尽管大多数甲状腺癌患者表现出良好的生存,但据报道,初次手术治疗后的复发率为8%至23%,这极大地影响了患者的生活质量[2]。近年来,研究表明,由于基因组不稳定或表观遗传标记改变导致的基因异常表达在甲状腺癌的调控中起着重要作用[3]。在众多理论中,竞争内源性RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)假说尤其受到人们的关注,这一假说描述一个由微小RNA(microRNA,miRNA)介导的复杂的转录后调控网络:通过共享一个或多个miRNA响应元件,长链非编码RNA(LncRNA)竞争性地与miRNA的结合,从而在功能上释放了受miRNA调控的靶mRNA[4]。然而,目前甲状腺癌中的ceRNA机制还不十分清楚,需要进一步的研究。心肌梗死相关转录物LncRNA(LncRNA-MIAT)是一种关键的促癌基因,已被研究证实在多种癌症中表达增高,而且可以参与调控肝癌和胃癌等恶性肿瘤的进展[5]。然而,LncRNA-MIAT在甲状腺癌中的作用与机制仍不十分清楚。本研究通过TCGA数据库(https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga)、Starbase(https://starbase.sysu.edu.cn/)、Targetscan(https://www.targetscan.org/vert_80/)等生物信息学网站预测到与LncRNA-MIAT相关的ceRNA网络中涉及28个miRNA和203个mRNA,其中在TCGA数据中miR-519d-3p在甲状腺癌中极低表达,而且MIAT和其中的EZH2在包括甲状腺癌在内的多种类型癌症中呈极显著正相关关系。因此我们假设LncRNA-MIAT可能在甲状腺癌中扮演促癌作用,且存在LncRNA-MIAT-miR-519d-3p-EZH2这条调控网络,并且本文通过体外实验研究了LncRNA-MIAT对甲状腺癌细胞恶性行为的调控作用并初步探讨了机制。

1 材料与方法

1.1细胞与主要试剂:人正常甲状腺细胞系Nthy-ori 3-1和人甲状腺癌细胞系FTC-133均购自中国科学院典型培养物保藏中心。胎牛血清(FBS)、DMEM培养基均购自美国Gibco公司。兔抗EZH2抗体、GAPDH抗体、辣根过氧化物酶(HRP)偶联的山羊抗兔 IgG二抗均购自英国Abcam公司。用于阻断EZH2活性的EPZ-6438购于美国MCE公司。免疫荧光原位杂交试剂盒购于上海碧云天公司。Cy3标记的抗小鼠二抗和Cy3标记的抗兔二抗均购于美国Abcam公司。

1.2方 法

1.2.1细胞培养和分组:①细胞培养FTC-133细胞和Nthy-ori 3-1细胞用含有10% FBS的DMEM培养基,置于37℃、5% CO2细胞培养箱中培养。②FTC-133细胞的转染和分组:分别将LncRNA-MIAT过表达载体(pcDNA3.1-LncRNA-MIAT,LncRNA-MIAT)、空载体(Empty vector)(均由上海吉玛公司进行构建)转染至FTC-133细胞,分别命名为LncRNA-MIAT组、Empty vector组。将miR-519d-3p inhibitor(购于上海吉玛公司)转染至FTC-133细胞,命名为miR-519d-3p inhibitor组。用APTO-263处理FTC-133细胞,命名为APTO-263组。另外,将LncRNA-MIAT过表达载体和miR-519d-3p inhibitor联合转染FTC-133细胞,命名为LncRNA-MIAT+miR-519d-3p inhibitor组。每组均孵育24h。进行后续检测。

1.2.2实时定量PCR:收集细胞的总RNA,逆转录为cDNA,行PCR扩增。以GAPDH为内参,采用2-△△CT法计算LncRNA-MIAT、miR-519d-3p、EZH2 mRNA的相对表达量。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成,序列见表1。

表1 PCR引物序列

1.2.3FISH实验:CY3标记的LncRNA-MIAT探针由广州瑞博生物有限公司设计合成。4%多聚甲醛固定FTC-133细胞,与含有LncRNA-MIAT探针的杂交缓冲液在37℃暗处杂交过夜。用DAPI(北京Solaribo)染细胞核。在荧光显微镜下观察切片。

1.2.4Western blot:提取各组细胞的总蛋白质。通过BCA蛋白检测试剂盒检测总蛋白浓度。然后实施SDS-PAGE分离蛋白质:70V 30min转120V 90min。然后将蛋白条带以300mA转移到PVDF膜上。在室温下用5%脱脂牛奶封闭2h后,将膜与一抗在4℃下孵育过夜:anti-EZH2(1∶1000),anti-GAPDH抗体(1∶2500)。然后,将膜与HRP偶联的山羊抗兔IgG(1∶2000)孵育1h。用ECL检测试剂显示蛋白条带,并用ImageJ软件分析每个条带的灰度值。

1.2.5双荧光素酶报告基因实验:合成含LncRNA-MIAT野生型(MIAT-wt)或突变型(MIAT-mut)结合位点的DNA片段,克隆到pMIR-GLO荧光素酶载体。分离重组质粒并测序。将miR-519d-3p mimics和mimics NC分别按照说明书使用Lipofectamine®3000与MIAT-wt/MIAT-mut片段共转染FTC-133细胞。转染4h后,更换培养基,将细胞置于37℃、5% CO2培养箱中培养48h。用双荧光素酶试剂盒检测各组的荧光素酶活性。另外,将合成的EZH2 3’UTR 野生型(EZH2-wt)或突变型(EZH2-mut)与miR-519d-3p mimics和mimics NC分别共转染FTC-133细胞,以检测miR-519d-3p都与EZH2的调控作用,其余实验方法同上。

1.2.65-乙炔基-2′-脱氧尿苷(EdU)染色实验:各组细胞用含50μM EdU试剂(美国RiboBio)的DMEM培养基在37℃、5% CO2下孵育2h。用PBS洗涤2次,用4%多聚甲醛固定30min,用2mg/mL甘氨酸溶液中和,加入100μL 0.5% Triton X-100进行通透性处理。PBS洗涤后,每孔加入100μL 1×Apollo染料,室温孵育30min。随后加入100μL DAPI,继续孵育10min,并在荧光显微镜下进行拍照。

1.2.7平板克隆形成实验:将各组FTC-133细胞浓度调整为1×103个/mL,培养在6孔板上,进行14d的常规培养,每隔3d换液一次,用甲醇固定并染色,对克隆计数并进行统计。

1.2.8流式细胞术:采用ACSVerse(美国BD公司)流式细胞仪对各组细胞进行进行Annexin V-FITC和PI染色。收集细胞并将细胞密度调整为5×105,总体积为200μL,再次离心弃掉上清,加入500μL 1×Binding Buffer,轻轻重悬细胞。随后加入5μL Annexin V-FITC和5μL PI轻轻混匀,室温避光下孵育15min,并用流式细胞仪进行检测。

1.2.9Transwell侵袭和迁移实验:细胞侵袭实验预先在上室膜(孔径为8μm)用基质胶涂层,将细胞(5×104/mL)悬浮在含无血清培养基的Transwell上室中,而下室充满含有20%FBS的培养基。孵育48h,去除上表面的剩余细胞,并固定膜下表面细胞,用结晶紫染色,在光学显微镜下(40x放大倍数)计数。细胞迁移实验除不预先对上室膜进行基质胶涂层外,其余同细胞侵袭实验。

2 结 果

2.1LncRNA-MIAT在甲状腺癌中的表达:从TCGA数据库中获取甲状腺癌中的基因表达数据,观察到与癌旁正常组比,THCA组的LncRNA-MIAT的表达升高1.5倍(t=2.664,P=0.008),见图1A。另外,qPCR结果显示,与Nthy-ori 3-1组(1.00±0.05)比,FTC-133组(4.12±0.31)中LncRNA-MIAT的表达增加3.2倍(t=17.210,P=2.5e-6),见图1B。通过FISH法检测人甲状腺癌细胞系FTC-133中LncRNA-MIAT的定位,结果显示,LncRNA-MIAT主要定位在细胞质内,见图1C。

图1 甲状腺癌中LncRNA-MIAT的表达

图2 甲状腺癌中LncRNA-MIAT下游靶点的预测和表达验证

2.2甲状腺癌中LncRNA-MIAT下游靶点的预测和表达验证:从TCGA数据库中获取甲状腺癌中的差异表达的miRNA和靶基因表达数据集,结合targetscan和starbase在线分析的miRNA-target和LncRNA-miRNA调控关系网络进行综合预测和分析,最终将甲状腺癌中LncRNA-MIAT下游靶点确定为miR-519d-3p和EZH2。TCGA数据库中观察到甲状腺癌中EZH2 mRNA的水平表达升高1.29倍(t=19.352,P=1.21e-11)。而且甲状腺癌中LncRNA-MIAT与EZH2的表达水平呈显著正相关(r=0.466,P=8.4e-29)。qPCR法检测Nthy-ori 3-1和FTC-133中miR-519d-3p的表达,结果显示,与Nthy-ori 3-1组比,FTC-133组中miR-519d-3p的表达降低92.3%(t=64.969,P=5.6e-15),而与Nthy-ori 3-1组比,FTC-133组中EZH2的mRNA表达和蛋白表达水平都上调,差异有统计学意义(t=23.461和19.729,P=1.5e-10和2.3e-5)。

2.3FTC-133中LncRNA-MIAT与miR-519d-3p和miR-519d-3p和靶基因EZH2的关系验证:miR-519d-3p mimics和MIAT-wt共转染抑制了荧光素酶活性,(t=4.225,P=0.007,图3A)。miR-519d-3p mimics和EZH2-wt共转染也抑制了荧光素酶活性(t=5.147,P=0.004,图3B)。与Empty vector组相比,LncRNA-MIAT组的LncRNA-MIAT明显上调(t=11.581,P=0.003,图3C),而miR-519d-3p的表达明显下调,EZH2的表达明显上调(t=12.054,P=0.002,图3D-3E)。对FTC-133细胞转染miR-519d-3p inhibitor后,观察到LncRNA-MIAT的表达水平无影响(P>0.05,图3C),而miR-519d-3p的表达明显下调,EZH2的表达明显上调(t=12.054和15.421,P=0.002和0.001,图3D-3E)。用EZH2的抑制剂EPZ-6438处理FTC-133细胞,对miR-519d-3p和LncRNA-MIAT的表达均无影响(P>0.05,图3C和图3D),可以明显抑制EZH2的表达(t=7.885和9.524,P=0.009和0.008,图3D-3E)。与LncRNA-MIAT组比,LncRNA-MIAT+miR-519d-3p inhibitor组的LncRNA-MIAT的表达无明显变化(P>0.05,图3C),而miR-519d-3p的表达被进一步抑制,EZH2的表达则被显著上调(t=5.887和6.251,P=0.019和0.011,图3D-3E)。另外,与miR-519d-3p inhibitor组比,LncRNA-MIAT+miR-519d-3p inhibitor组的miR-519d-3p的表达被进一步抑制,EZH2的表达则被显著上调(t=8.207和4.984,P=0.005和0.016,图3D-3E)。

图3 甲状腺癌中LncRNA-MIAT、miR-519d-3p和EZH直接关系的实验验证

2.4LncRNA-MIAT通过抑制miR-519d-3p激活EZH2调控甲状腺癌细胞的增殖:与Empty vector组相比,LncRNA-MIAT组的EdU阳性细胞百分比和克隆细胞数均显著上调(P<0.05)。FTC-133细胞转染miR-519d-3p inhibitor后,观察到Edu阳性细胞百分比和克隆细胞数均显著上调(P<0.05)。EZH2的抑制剂EPZ-6438则明显抑制EdU阳性细胞百分比和克隆细胞数(P<0.05)。与LncRNA-MIAT组比,LncRNA-MIAT+miR-519d-3p inhibitor组的Edu阳性细胞百分比和克隆细胞数均显著上调(P<0.05)。与miR-519d-3p inhibitor组比,LncRNA-MIAT+miR-519d-3p inhibitor组的EdU阳性细胞百分比和克隆细胞数均显著上调(P<0.05)(图4A-4D)。

图4 LncRNA-MIAT通过抑制miR-519d-3p激活EZH2调控甲状腺癌细胞增殖

2.5LncRNA-MIAT通过抑制miR-519d-3p激活EZH2调控甲状腺癌细胞的凋亡:与Empty vector组相比,LncRNA-MIAT组的细胞凋亡率显著下调(P<0.05)。FTC-133细胞转染miR-519d-3p inhibitor后,观察到细胞凋亡率显著下调(P<0.05)。而EZH2的抑制剂EPZ-6438明显增加了细胞的凋亡率(P<0.05)。与LncRNA-MIAT组比,LncRNA-MIAT+miR-519d-3p inhibitor组的细胞凋亡率显著下调(P<0.05)。与miR-519d-3p inhibitor组比,LncRNA-MIAT+miR-519d-3p inhibitor组的细胞凋亡率也显著下调(P<0.05)(图5)。

图5 LncRNA-MIAT通过抑制miR-519d-3p激活EZH2调控甲状腺癌细胞的凋亡

2.6LncRNA-MIAT通过抑制miR-519d-3p激活EZH2调控甲状腺癌细胞的侵袭和迁移:与Empty vector组相比,LncRNA-MIAT组的细胞侵袭数和细胞迁移数显著上调(P<0.05)。FTC-133细胞转染miR-519d-3p inhibitor后,观察到细胞侵袭数和细胞迁移数显著上调(P<0.05)。而EZH2的抑制剂EPZ-6438明显减少了细胞侵袭数和细胞迁移数(P<0.05)。与LncRNA-MIAT组比,LncRNA-MIAT+miR-519d-3p inhibitor组的细胞侵袭数和细胞迁移数显著下调(P<0.05)。与miR-519d-3p inhibitor组比,LncRNA-MIAT+miR-519d-3p inhibitor组的细胞侵袭数和细胞迁移数也显著下调(P<0.05)(图6A-6C)。

图6 LncRNA-MIAT通过抑制miR-519d-3p激活EZH2调控甲状腺癌细胞的侵袭和迁移

3 讨 论

甲状腺癌患者的预后通常较为良好,因为手术或者放射性碘治疗,在大多数情况下都可以实现完全改善[5]。然而,目前的诊断和治疗策略并不完全有效。在过去的几十年里,研究人员已经确定甲状腺肿瘤发生是一个复杂的生物学过程,其特征是多种非编码RNA分子的异常表达,主要包括miRNA和LncRNA,这些分子在过去十年中被多次提出可作为癌症通路的调节因子,并有作为癌症预后生物标志物的潜力[6]。我们发现在甲状腺癌细胞系中LncRNA-MIAT表达明显上调,而miR-519d-3p明显下调。而且在本研究中,通过双荧光素酶基因报告法我们发现在甲状腺癌细胞中LncRNA-MIAT与miR-519d-3p相互作用,从而调控了EZH2信号,这在甲状腺癌的发生发展中具有重要作用。

LncRNA-MIAT最初被认为与心肌梗死相关,但研究表明沉默MIAT显著抑制内皮细胞增殖和迁移[7]。研究人员发现LncRNA-MIAT/miR-150-5p/ZEB1信号通路在非小细胞肺癌中起致癌作用[8]。而且,LncRNA-MIAT通过与miR-361-3p的结合,可以促进前列腺癌的发展,下调LncRNA-MIAT通过上调miR-361-3p的表达抑制前列腺癌细胞的活力并诱导细胞凋亡[9]。表明,LncRNA-MIAT是一种促癌基因,可以通过调控miRNA促进肿瘤的进展。本研究在甲状腺癌中同样证实了是一种促癌基因,促进了癌细胞的增殖、迁移和侵袭,并抑制细胞凋亡,这种功能与其直接靶点miR-519d-3p密切相关,因为LncRNA-MIAT过表达和miR-519d-3p inhibitor的功能几乎一致,均促进了癌细胞的增殖、迁移和侵袭,抑制了细胞凋亡。因此,我们的研究表明,LncRNA-MIAT通过抑制miR-519d-3p促进了甲状腺癌的进展。

EZH2是本研究中的另一个关键靶点。它是多梳抑制复合体2的核心成分之一,多梳抑制复合体的作用是赖氨酸甲基转移酶,特别是催化H3K27me3的甲基化[10]。EZH2表达升高在包括甲状腺癌在内的多种癌症中均被广泛认可,其表达与肿瘤恶性、侵袭性和不良预后密切相关。LncRNA已被证明可以通过转录后机制直接或间接地调节EZH2的水平。如在胃癌中,LINC00673通过与LSD1和EZH2相互作用调节致癌生物学行为[11]。而miRNA则可以与EZH2 mRNA转录本结合,调控其稳定性、完整性和翻译,从而直接影响EZH2蛋白的表达。例如,miR-101-3p通过转录后下调EZH2,降低多种肿瘤类型的侵袭和迁移能力,包括成神经管细胞瘤和食管鳞状细胞癌[12,13]。总的来说,这些观察结果是我们关于LncRNA-MIAT、miR-519d-3p和EZH2之间关系猜想的基础。本研究通过双荧光素酶报告实验证实了中LncRNA-MIAT与miR-519d-3p的靶向关系以及miR-519d-3p与EZH2的靶向关系。并且通过抑制EZH2对甲状腺癌细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡的影响与miR-519d-3p inhibitor和过表达LncRNA-MIAT明显相反。而且 miR-519d-3p inhibitor可以上调EZH2的表达,LncRNA-MIAT过表达也可以抑制miR-519d-3p并上调EZH2的表达。因此,这表明,LncRNA-MIAT可以通过抑制miR-519d-3p上调EZH2,从而促进甲状腺癌细胞增殖、迁移、侵袭并抑制细胞凋亡。

综上所述,甲状腺癌中LncRNA-MIAT表达显著增加,过表达LncRNA-MIAT抑制甲状腺癌细胞凋亡,促进甲状腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭行为,其关键分子机制是通过抑制miR-519d-3p上调EZH2的表达。我们的研究为LncRNA-MIAT在癌症中的作用提供了新的见解,并可能有助于甲状腺癌治疗和诊断诊断工具的开发。