度拉糖肽对脓毒症小鼠急性肾损伤的保护作用

邓凤仪,王 跃,范星宇,邓胡静,钟 兴,杜益君,苏 虹,潘天荣

脓毒症(sepsis)是指机体对各种感染所致的炎症反应失调,从而导致危及生命的器官功能障碍,其中约60%的脓毒症患者会出现不同程度的肾功能损伤[1]。脓毒症急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)作为脓毒症的常见并发症,与其他器官衰竭和患者病死率的增加密切相关[1]。脓毒症AKI的特征是肾功能在短时间内急剧下降,发病机制涉及微血管障碍、肾小管损伤、促炎因子产生和免疫细胞活化等,但目前尚缺乏有效治疗。因此,积极探索脓毒症AKI的潜在机制和有效治疗方案是医学界关注的重点。

胰高糖素样肽-1受体激动剂(glucagon-like peptide-1 receptor agonist,GLP-1RA)-度拉糖肽(dulaglutide)已被广泛用于2型糖尿病的治疗。近期研究[2]显示,度拉糖肽可以减轻脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的心肌细胞损伤,表明其可能在炎性疾病中具有一定保护作用。目前对于度拉糖肽在脓毒症AKI中的作用及机制尚不清楚。该研究通过小鼠腹腔注射LPS诱导脓毒症AKI模型,使用度拉糖肽干预后检测肾脏生化指标、炎性因子及免疫细胞的变化情况,探讨度拉糖肽对脓毒症AKI的保护机制。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂LPS(货号:L8880)购自北京索莱宝科技有限公司;度拉糖肽(货号:D424037)购自美国礼来公司;肌酐(creatinine,CRE)试剂盒(货号:C011-2-1)、血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)试剂盒(货号:C013-2-1)均购自南京建成生物工程研究所; F4/80抗体(货号:DF2789)购自江苏AffinityBiosciences公司;MPO抗体(货号:22225-1-AP)购自武汉三鹰生物技术有限公司;HRP标记的抗兔二抗(货号:EAB1004)购自武汉伊莱瑞特生物科技公司。

1.2 动物模型的建立与分组研究使用6～8周龄SPF级别雄性C57BL/6小鼠,体质量(20±3) g。小鼠饲养在安徽医科大学第二附属医院中心实验室,光照条件:昼夜各12 h,自由饮水和饮食。小鼠适应性饲养7 d后,将小鼠随机分为Control组、LPS组、LPS+Dul组和Dul组,每组6只。LPS组小鼠以15 mg/kg剂量腹腔注射LPS,Dul组小鼠以0.6 mg/kg剂量腹腔注射度拉糖肽,LPS+Dul组以相同剂量同时注射LPS和度拉糖肽,Control组注射等量生理盐水。24 h后处死小鼠,收集血液以及肾脏组织用于后续研究。该研究经安徽医科大学第二附属医院科研中心审核批准,伦理审查批准号为20211123。

1.3 小鼠血CRE、BUN的检测取得各组小鼠全血后,4 ℃、3 000 r/min, 离心20 min,获取血清,按照试剂盒说明书依次加入试剂,采用酶标仪进行相应吸光度检测。

1.4 肾脏HE染色处死小鼠后,取肾脏放入4%多聚甲醛固定,经石蜡包埋切片,进行苏木精-伊红染色,由医院2位病理科医生进行双盲法阅片,随机观察3个视野评价肾小管受损情况及受损面积,肾损伤评分如下:正常肾组织0分,肾小管受损面积为1%～25%为1分、26%～50%为2分、51%～75%为3分、76%～100%为4分[3]。

1.5 肾脏F4/80、MPO免疫组化肾脏石蜡切片常规脱蜡复水后,使用柠檬酸钠进行抗原修复,用10%山羊血清室温封闭切片30 min,切片滴加一抗后放入4 ℃冰箱孵育过夜。第2天采用HRP-DAB系统显色,随后用苏木精复染。乙醇脱水,二甲苯透明后封片,在镜下观察染色情况。

1.6 qRT-PCR检测肾脏组织中相应炎性因子mRNA变化用TRIzol试剂从肾组织中提取总RNA,用逆转录试剂盒合成cDNA,按照SYBR试剂盒加样后放入PCR系统进行实时定量PCR。扩增结束后统计各组Ct值,采用相对定量2-△△Ct方法评估相对基因表达。所有引物均由Genscript公司定制。引物设计见表1。

表1 用于定量实时聚合酶链反应的引物序列

2 结果

2.1 度拉糖肽对脓毒症AKI小鼠体质量和肾脏质量的影响与Control组相比,LPS组小鼠的体质量减轻(F=4.93,P<0.001),而双侧肾脏相对重量增加(F=2.16,P<0.001)。与LPS组相比,LPS+Dul组小鼠体质量有所增加(F=15.79,P<0.05),而双侧肾脏相对重量降低(F=1.63,P<0.001)。见图1。

图1 各组小鼠体质量与肾脏质量A:各组小鼠给药24 h后体质量; B:各组小鼠给药24 h后肾脏质量/体质量比值;1:Control组:2:LPS组;3:LPS+Dul组;4:Dul组;与Control组比较:***P<0.001;与LPS组比较:#P<0.05,###P<0.001

2.2 度拉糖肽对脓毒症AKI小鼠肾功能的影响检测4组小鼠血CRE与BUN水平,与Control组相比,LPS组小鼠的血CRE与血BUN水平升高(FCRE=9.20,P<0.01,FBUN=69.02,P<0.001);与LPS组相比,度拉糖肽治疗后降低了LPS+Dul组小鼠血清中CRE和BUN的水平(FCRE=5.98,FBUN=1.52,均P<0.01)。见图2。

图2 各组小鼠肾功能的情况A:各组小鼠血清CRE;B:各组小鼠血BUN;1:Control组;2:LPS组;3:LPS+Dul组;4:Dul组;与Control组比较:**P<0.01,***P<0.001;与LPS组比较:##P<0.01

2.3 度拉糖肽对脓毒症AKI小鼠肾组织形态学影响HE染色显示,Control组肾间质和皮质未见炎症细胞浸润,未见肾小管上皮细胞病理改变。LPS组和LPS+Dul组可见肾皮质和间质出现炎症细胞浸润,肾小管上皮细胞出现肿胀,小管刷状缘消失,空泡变性,但LPS+Dul组病理学改变较LPS组轻。见图3A。与Control组相比,LPS组肾损伤评分升高(F=22.60,P<0.001);与LPS组相比,LPS+Dul组肾损伤评分降低(F=6.65,P<0.05)。见图3B。

图3 各组小鼠HE染色情况 A:各组小鼠HE染色光镜图 ×100(左)×200(右);B:各组小鼠肾损伤评分;1:Control组;2:LPS组;3:LPS+Dul组;4:Dul组;与Control组比较:***P<0.001;与LPS组比较:#P<0.05

2.4 度拉糖肽对脓毒症AKI小鼠肾组织中促炎因子的影响与Control组相比,LPS组小鼠肾脏组织中促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表达水平升高(FIL-1β=5.33,FIL-6=286.10,FTNF-α=1.34,均P<0.05);与LPS组相比,给予度拉糖肽处理后LPS+Dul组小鼠肾组织中炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表达水平降低(FIL-1β=9.38,P<0.05;FIL-6=151.60,P<0.05;FTNF-α=12.97,P<0.01)。见图4。上述结果表明度拉糖肽处理后可通过减轻炎症反应缓解LPS诱导的AKI。

2.5 度拉糖肽对脓毒症AKI小鼠肾组织中炎性细胞浸润的影响F4/80免疫组化染色检测巨噬细胞浸润情况,与Control组相比,LPS组中巨噬细胞浸润增加(F=133.40,P<0.001);与LPS组相比,LPS+Dul组小鼠肾内巨噬细胞浸润程度减轻(F=11.09,P<0.01)。见图5A。MPO免疫组化染色检测中性粒细胞浸润情况,与Control组相比,LPS处理后中性粒细胞浸润增加(F=8.68,P<0.001);经度拉糖肽处理后,中性粒细胞浸润程度出现降低趋势,差异无统计学意义。见图5B。

3 讨论

脓毒症AKI是临床危重患者的常见并发症,有着极高的发病率和病死率[4]。临床上的治疗主要包括维持内环境稳态、抗感染、使用血管活性药物乃至肾脏替代治疗(RRT)等,但对脓毒症AKI患者并不能产生很好的疗效,因此亟待寻找新的治疗手段。度拉糖肽是属于GLP-1RA的一种新型降糖药,以葡萄糖依赖的方式促进胰岛素分泌和减少胰高血糖素分泌等来控制血糖[5]。一项大型临床研究[6]显示,度拉糖肽治疗可以通过降低尿白蛋白来减少肾脏疾病进展,并且其降低蛋白尿的效应很大程度上独立于对血糖、血压的影响,也不依赖于血管紧张素转化酶抑制剂或血管紧张素II受体拮抗剂的使用,提示度拉糖肽可能有降糖以外的肾脏的保护作用。有证据表明,GLP-1RA通过抑制炎症、减少氧化应激和保护内皮功能直接影响肾脏[7]。本研究使用LPS构建脓毒症AKI模型,结果显示LPS可导致小鼠肾功能受损,检测促炎因子增加,炎性细胞浸润增加,度拉糖肽干预后炎性反应明显改善,提示度拉糖肽可改善LPS诱导的脓毒症AKI小鼠的肾功能,减轻炎性反应。

既往研究[8]表明,LPS诱导的脓毒症AKI中,会出现急性肾功能下降、肾小球萎缩、肾小管扩张、肾小管空泡化等现象。本研究显示,与Control组相比,LPS刺激诱导下的小鼠血清CRE、BUN显著升高,肾脏中肾小管上皮细胞出现空泡样变、水肿、管腔变小,部分刷状缘消失,而度拉糖肽改善了肾功能,减轻了肾脏病理损伤,从而缓解了肾脏急性损伤。与此同时,LPS诱导后的小鼠出现体质量下降,而相对肾脏重量增加,这可能与脓毒症AKI所致的内环境紊乱有关,小鼠体液丢失,进食量和摄水量减少,从而导致体质量减轻,而肾脏由于炎性细胞浸润、水肿等,出现肿大。度拉糖肽处理后,改善了LPS诱导的小鼠体质量下降和肾脏质量的增加。本研究显示,单独应用度拉糖肽的小鼠也出现了体质量减轻,考虑与度拉糖肽的药理作用相关,即GLP-1RA可以通过抑制食欲和促进胃排空来减重[9]。

脓毒症AKI与炎症反应的激活密切相关,包括促炎因子大量分泌、补体系统激活、凝血系统和内皮细胞活化等,其中促炎因子的过量产生被认为是LPS诱导的脓毒症AKI的重要致病因素[10]。研究[11]表明,具有抗炎活性的药物治疗可以抑制脓毒症AKI的进展。在各种动物实验中,度拉糖肽也被证实能抑制炎症进展[12]。本研究结果显示,使用LPS诱导AKI后,小鼠肾脏组织中促炎因子IL-6、IL-1β、TNF-α表达明显升高,注射度拉糖肽后可显著抑制炎性因子的分泌,提示度拉糖肽具有良好的抗炎作用。

炎症反应的发展往往伴随着免疫细胞的浸润,而肾实质细胞、免疫细胞和微环境异常可导致炎症反应失控,导致肾损害。巨噬细胞是常见的吞噬细胞,在趋化因子作用下迁移到特定部位清除入侵的病原体或衰老/凋亡细胞,并可促进中性粒细胞转运[13]。研究[14]显示,LPS诱导的脓毒症AKI小鼠肾脏中巨噬细胞的浸润增加,并伴随促炎因子的升高。在急性炎症中,中性粒细胞往往是第一个迁移到组织并释放趋化因子以促进单核细胞迁移到组织的免疫细胞[15]。本研究表明LPS诱导的脓毒症AKI小鼠肾脏组织中,巨噬细胞和中性粒细胞的浸润明显增加,度拉糖肽显著地抑制了巨噬细胞的浸润,对中性粒细胞的浸润也有部分改善作用。

综上所述,度拉糖肽可改善LPS诱导的脓毒症AKI小鼠的肾脏功能及炎性损伤,度拉糖肽可能通过减轻炎性反应而对脓毒症AKI发挥保护作用。