角鲨烯环氧化酶通过调控AKT/mTOR信号通路促进卵巢癌细胞的糖代谢

王亮亮,马珊珊,周黎,王丽华

(蚌埠医学院第一附属医院肿瘤妇科,安徽 蚌埠 233000)

卵巢癌是女性常见的妇科恶性肿瘤[1]。它的流行率和发病率仍然很高,影响到世界上许多妇女。目前,卵巢癌的标准治疗方法包括手术切除和化疗,但由于肿瘤复发和远处转移,卵巢癌患者的5年生存率仍小于50%[2]。因此,发现卵巢癌的分子发病机制、新的预后生物标志物和治疗靶点对卵巢癌的预后和治疗具有重要意义。

角鲨烯环氧化酶(squalene epoxidase,SQLE) 在人类染色体8q24.13上被发现,催化角鲨烯立体特异性转化为2,3(S)-氧化二烯,它是胆固醇生物合成的关键步骤,被认为是胆固醇合成的第二限速酶[3]。研究报道[4-5],SQLE在许多恶性肿瘤中过表达,SQLE 在乳腺癌[6]、结肠癌[7]等表达差异,高表达促进癌症的发生。研究表明SQLE作为miR-205 的直接下游靶基因,影响前列腺癌的预后[8]。代谢紊乱、过度肥胖、脂肪因子可能与卵巢癌的发病、恶性进展以及耐药等有关,既是卵巢癌发病的原因之一,又导致了卵巢癌的恶性进展以及极差的预后。SQLE作为胆固醇代谢相关基因在卵巢癌中是否也存在与前列腺癌相类似调控癌症的作用。本研究通过观察SQLE对卵巢癌细胞增殖和凋亡的影响,及对糖代谢的影响,以期为卵巢癌的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1研究对象 本课题组收集蚌埠医学院第一附属医院2022年1月至2022年12月妇瘤科手术的50例卵巢癌患者相关信息,及其手术切除癌组织及癌旁正常组织(距离癌切缘≥3 cm)。术中采集的标本立即放入-80 ℃冰箱保存,留为后续实验使用。所有病人均有明确的诊断,且术前均未接受过任何治疗。所有患者均签署知情同意书,且本研究由蚌埠医学院第一附属医院伦理委员会批准。

1.2细胞培养及其主要试剂 正常人源卵巢细胞IOSE-80和卵巢癌细胞OVCAR-3、ES-2、A2780购自上海中科院细胞库;使用10%胎牛血清(FBS)(赛默飞有限公司)的1640培养基(赛默飞有限公司)培养,培养基包含10%胎牛血清(赛默飞有限公司)+1%青链霉素。细胞在37 ℃、含5%CO2的培养箱中培养。敲减SQLE(si-SQLE)及对照NC的慢病毒由合元生物技术(上海)股份有限公司设计合成;四甲基偶氮唑盐(MTT)购自北京索莱宝科技有限公司;Western Blot试剂盒及BCA蛋白浓度测量试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司;Annexin V-FITC/PI 双染细胞凋亡检测试剂盒购自上海贝博生物科技有限公司;6孔板购自于NEST公司;一抗(SQLE、GLUT1、LDH、AKT、mTOR、p-AKT、p-mTOR和GAPDH)均购买于Abcam公司,二抗购于武汉三鹰生物技术有限公司;葡萄糖、乳酸、腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)检测试剂盒购自赛默飞有限公司。

1.3细胞转染 取对数生长期细胞,于转染前24 h将细胞以3.0×104个/孔接种于6孔板;转染时按照脂质体Lipofectamine TM2000转染试剂盒说明书,A2780细胞转染敲减SQLE及对照组试剂,记作si-SQLE及NC。转染时加入相应试剂并混合均匀,将细胞培养基换为无血清培养基,5% CO2、37 ℃ 条件培养箱培养6 h后更换新鲜培养基,然后进行后续实验。序列为si-SQLE:5′-GCCGGGUGGUUAUCAUGUUTT-3′。

1.4克隆实验 克隆实验检测增殖情况,取转染好的细胞消化离心后,以1 000个/孔的密度种植于6孔板中,加入含10%的培养基,随后培养10 d。去上清后,加入4%的多聚甲醛固定30 min后,加入1∶8稀释后的结晶紫染液,染色30 min后PBS冲洗3～4遍,拍照计数。

1.5流式细胞术检测细胞凋亡情况 收集各组转染后细胞培养皿中的上清液,消化细胞,适度离心,丢弃上清液,加入 PBS 轻轻洗涤,再次适度离心,丢弃上清液,加入适量结合液,严格按照凋亡试剂盒说明书避光加入染料,最后用滤膜滤过细胞碎片,上流式细胞仪进行检测。

1.6Western Blot实验 收集细胞,用裂解液(上海碧云天生物技术有限公司生产)提取总蛋白裂解物,用于蛋白印迹实验,使用BCA蛋白检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司生产)测定蛋白浓度。待定量后,将等量配置好的蛋白质(40 μg)加载到凝胶上,在10%凝胶上电泳分离,然后转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。用TBST洗膜5分钟/次,共3次,用5%脱脂乳溶液封闭PVDF膜封闭1 h,然后与一抗抗体(1∶1000)的一抗孵化,4 ℃孵育过夜。第2天用TBST溶液清洗膜3次,再与二抗在37 ℃下孵育1 h。

1.7检测葡萄糖、乳酸和ATP的含量 将培养24 h的细胞上清液,按照葡萄糖检测试剂盒和乳酸检测试剂盒的说明书进行处理,使用酶标记,在505 nm和530 nm处测量上清液的吸光度。按照ATP检测试剂盒说明书要求,取细胞悬浮液,将基质和缓冲液混合制成测试溶液。将测试溶液加入细胞中并混合以使细胞完全裂解。使用可检测化学发光的多功能酶标记物在636 nm处测定吸光度。

2 结果

2.1SQLE在卵巢癌患者中高表达 免疫组化检测结果显示,卵巢癌组织蜡块与其相匹配的癌旁正常组织中,SQLE蛋白在癌组织中阳性表达明显高于癌旁正常组织(P<0.001),见表1和图1。

图1 SQLE在卵巢癌组织及癌旁组织中的表达水平

表1 SQLE在卵巢癌组织及癌旁组织中的表达水平

2.2SQLE在卵巢癌细胞中高表达 通过蛋白印迹检测实验检测SQLE在卵巢癌细胞中的表达情况,结果显示,与IOSE-80相比,在卵巢癌细胞系A2780、ES-2和OVCAR-3中的SQLE表达明显增加,差异有统计学意义(P<0.05),见图2。

注:A.Western Blot检测SQLE在卵巢癌细胞株中的蛋白表达量;B.SQLE蛋白的表达量(n=3)。*P<0.05。

2.3SQLE转染效率检测 转染后24 h后通过蛋白印迹实验检测SQLE的表达情况,确定转染效率。结果显示,在A2780卵巢癌细胞中,相较于NC组,si-SQLE组中的SQLE表达水平显著下降,差异有统计学意义(P<0.05)。见图3。

注:A.Western Blot检测敲减后SQLE的蛋白表达量;B.SQLE蛋白表达量(n=3)。*P<0.05。

2.4敲减SQLE表达抑制卵巢癌细胞增殖 克隆实验显示,敲减SQLE表达水平后,si-SQLE组在A2780卵巢癌细胞中,相较于NC组细胞克隆数目显著减少,两组差异具有统计学意义(P<0.05)。见图4。

注:A.克隆形成实验;B.克隆形成统计结果。*P<0.05。

2.5敲减SQLE表达促进A2780卵巢癌细胞凋亡 流式细胞术结果显示,敲减 SQLE 表达后相较于对照组NC,si-SQLE组细胞凋亡率增加,差异均具有统计学意义(P<0.05)。见图5。

注:A.流式细胞仪检测凋亡细胞;B.统计凋亡结果。*P<0.05。

2.6SQLE对沃伯格效应影响 在A2780卵巢癌细胞中,相较于NC组,si-SQLE组蛋白GLUT1、LDH表达显著下降(P<0.05)。见图6。

注:A.Western Blot检测敲减SQLE后的糖代谢蛋白表达量;B.统计蛋白表达量结果(n=3)。*P<0.05。

2.7敲减SQLE表达后抑制卵巢癌细胞葡萄糖、乳酸和ATP的含量 与NC对照组相比,抑制SQLE 表达后细胞葡萄糖消耗水平显著降低(P<0.05),乳酸水平和 ATP 水平显著降低(P<0.05)。见图7。

注:A.葡萄糖消耗;B.乳酸含量;C.ATP含量。*P<0.05。

2.8敲减SQLE表达后抑制蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶点(protein kinase B/mammalian target of rapamycin,AKT/mTOR)信号通路蛋白 Western Blot实验显示,敲减SQLE表达水平后,与NC组比较,si-SQLE组中的AKT、mTOR蛋白水平差异无统计学意义,p-AKT、p-mTOR蛋白水平显著下降,差异有统计学意义(P<0.05)。见图8。

注:A.Western Blot检测敲减SQLE后的AKT/mTOR信号通路蛋白表达量;B.统计蛋白表达量结果(n=3)。*P<0.05。

3 讨论

卵巢癌是世界范围内女性癌症相关死亡的最常见原因之一。尽管手术和靶向化疗取得了一定进展,但由于复发和化疗耐药,预后仅略有改善[9]。并且卵巢癌早期病变不易被发现,晚期病例患者的治疗方法有限[10]。因此,深入了解卵巢癌的发病机制,对于制定新的治疗策略,改善卵巢癌患者的整体预后具有重要意义。SQLE是胆固醇合成一个关键酶。研究发现,SQLE在多种肿瘤中通过不同途径发挥促癌因子的作用[11-12]。然而,SQLE在卵巢癌中的作用机制尚不清楚。本课题组收集本院50例卵巢癌患者临床数据,免疫组化检测发现SQLE在卵巢癌组织中高表达。同时,进一步利用蛋白印迹方法,检测SQLE在卵巢癌细胞株中的表达情况,验证了SQLE在卵巢癌中高表达。这些研究结果均提示SQLE在卵巢癌中可能是促癌因素。为了进一步研究SQLE对卵巢癌的影响,本课题组利用转染技术,通过体外实验检验SQLE对增殖及凋亡的影响。克隆形成结果显示,敲减SQLE后,A2780卵巢癌细胞增殖能力受到抑制。流式细胞仪结果显示,敲减SQLE后促进了A2780卵巢癌细胞的凋亡。这些结果说明SQLE影响卵巢癌的发生和发展。

肿瘤的发生与多种因素相关。癌细胞中的能量代谢通过称为沃伯格效应的过程不同于正常细胞。这种代谢重编程的特点是,即使在存在足够氧气的情况下,癌细胞或其他高度增殖的细胞也倾向于将葡萄糖代谢成乳酸,而不是丙酮酸(有氧糖酵解)。这种现象为癌细胞提供了生长优势,帮助它们逃避凋亡并促进肿瘤转移[13-14]。虽然,有一些文献报道,SQLE与胆固醇代谢相关,但是,SQLE是否影响糖代谢少见有报道。本课题组为了探索SQLE对卵巢癌影响的机制,通过蛋白印迹实验检测沃伯格效应关键蛋白,结果显示,敲减SQLE表达水平后,蛋白GLUT1、LDH表达显著下降。抑制SQLE 表达后细胞葡萄糖消耗水平显著降低,乳酸水平和 ATP 水平显著降低,推测SQLE可能通过影响糖代谢影响卵巢癌的发生发展。AKT/mTOR信号通路参与多种癌症进程,是人们熟知的信号通路[15-16]。mTOR是两种蛋白质复合物的催化亚基,而PI3K-AKT通路是mTOR通路的重要调控因子[17]。AKT可以通过CAT结构域介导酶活性,这是AKT激活所必需的磷酸肌醇依赖性激酶1(PDK1)依赖性磷酸化位点,从而激活mTORC1。mTOR通路被认为是代谢功能的关键调节因子。mTORC1通过上调转录因子如HIF1α的激活参与葡萄糖摄取和糖酵解。有研究证明,一些蛋白可以通过激活AKT/mTOR信号通路影响糖代谢,进而影响癌症的发生发展[18-19]。本课题组利用蛋白印迹实验检测AKT/mTOR信号通路关键蛋白,验证SQLE是否通过AKT/mTOR信号通路影响卵巢癌。结果显示,敲减SQLE表达水平后,AKT/mTOR信号通路关键蛋白表达也随之下降。这表明SQLE可能调控AKT/mTOR信号通路。综合本研究前期实验结果,抑制SQLE 表达后细胞葡萄糖消耗水平显著降低,乳酸水平和 ATP 水平显著降低,间接推测SQLE可能调控AKT/mTOR信号通路调控糖代谢。

综上所述,本研究主要发现SQLE在卵巢癌中表达明显升高,并且可能通过AKT/mTOR信号通路调控糖代谢及细胞凋亡,这为日后治疗卵巢癌提供了新思路。