ABCA8在结直肠癌中的生物信息学分析及验证

台维龙,黄天赋,曹宇生,梁浩源,黄许森

(1.右江民族医学院研究生学院,广西 百色 533000;2.右江民族医学院附属医院心胸血管外科,广西 百色 533000;3.右江民族医学院附属医院胃肠外科,广西 百色 533000)

结直肠癌是一种在任何年龄都可发病,源于结肠和直肠的癌症。其发病隐秘,症状早期多为大便性状改变,腹痛等,通常不会引起患者的注意[1]。在2000年到2016年期间,男性前列腺恶性肿瘤、结肠直肠恶性肿瘤、白血病、脑恶性肿瘤、胰腺恶性肿瘤、膀胱恶性肿瘤发病率呈上升趋势;而在女性中,甲状腺恶性肿瘤、宫颈恶性肿瘤、子宫恶性肿瘤、结肠直肠恶性肿瘤、肺恶性肿瘤、乳房恶性肿瘤的发病率明显上升[2-3]。无论男性或女性,结直肠癌的发病率和死亡率均呈升高趋势。ATP结合盒亚家族A成员8(ATP-binding cassette subfamily A member 8,ABCA8)是ABC Transporter超级家族的成员。其中,人类有48个转录活性被分为7个亚家族,分别为A-G家族。ABCA1和ABCA8是同源的,而且ABCA1被认为可抑制多种癌症的增殖和转移[4-8]。然而,ABCA8在肿瘤发生中的作用和作用机制尚不清楚,尤其是在结直肠癌中。

1 方法

1.1下载TCGA数据库中结直肠癌的数据 通过TCGA数据库下载到了关于结直肠癌的514名结直肠癌患者和健康对照患者的样本数据。TCGA数据库是由美国国家癌症研究所(National Cancer Institute,NCI)和国家人类基因组研究所(National Human Genome Research Institute,NHGRI)合作建立的癌症研究项目,通过收集整理癌症相关的各种组学数据,提供了一个大型的、免费的癌症研究参考数据库。

1.2ABCA8在结直肠癌中的表达情况 提取了ABCA8基因在结直肠癌患者样本和健康对照样本中的表达情况,随即利用R包Limma包对ABCA8基因的表达差异进行分析,并且绘制箱线图以及样品配对差异箱线图。

1.3ABCA8和结直肠癌之间预后相关性分析 通过TCGA数据库下载结直肠癌的临床数据文件,删除正常样品的数据,并且根据ABCA8基因的表达量对结直肠癌样品进行分组,分为高、低风险组。随即,将样品的生存数据和ABCA8的表达数据进行合并,通过survival 和surminer R包进行分析,比较高、低表达组之间生存差异,并得到显著性分析的P值,最后绘制生存曲线。

1.4基因相关性分析 设置相关性分析的过滤条件,相关性系数≥0.6,且相关性检验P<0.001。随即对结直肠癌的数据表达集进行分析,删除正常样品,提取ABCA8基因在肿瘤样品中的表达情况,并且提取其他基因在肿瘤样本内的表达量,随即对ABCA8基因和其他基因的表达情况进行相关性检验,并且根据过滤条件得到满足条件的基因,并且绘制相关性系数散点图,以及利用circlizeR包绘制相应圈图。

1.5肿瘤免疫微环境分析 通过运行estimatebR包,得到每个结直肠癌肿瘤样品的免疫微环境打分,并且根据ABCA8基因的表达情况得到高表达ABCA8的分组和低表达ABCA8的分组之间的肿瘤免疫微环境打分情况并绘制小提琴图。

1.6免疫细胞浸润相关分析 Cibersort是目前引用次数最多的免疫细胞浸润估计分析工具。CIBERSORT是基于线性支持向量回归(linear support vector regression)原理对人类免疫细胞亚型的表达矩阵进行去卷积的工具。用于芯片表达矩阵和测序表达矩阵,对未知混合物和含有相近的细胞类型的表达矩阵的去卷积分析优于其他方法。本研究使用cibersort的官方提供的源代码,指定基准数据库文件,并利用结直肠癌的数据文件进行分析计算免疫细胞,得到免疫浸润的结果。利用ABCA8基因表达量的不同对两个分组进行差异分析,并且通过ABCA8和每个免疫细胞在肿瘤样本中的表达情况进行相关性检验,筛选符合过滤条件(P<0.05)的免疫细胞,绘制ABCA8基因和符合过滤条件的免疫细胞的相关性系数散点图和棒棒糖图。

1.7免疫检查点分析 通过文献得到79个免疫检查点相关基因[9],并且得到其在结直肠癌肿瘤样品中的表达情况,通过对免疫检查点相关基因和ABCA8基因在结直肠癌肿瘤样本中的表达情况进行相关性检验,设置过滤条件相关性检验P<0.001,随即利用R包corrplot包绘制符合过滤条件的免疫检查点基因和ABCA8基因的相关性分析的图形。

1.8ABCA8在临床患者中的表达情况 自2022年5月到2022年12月期间收集于右江民族医学院附属医院的15例结直肠癌患者的癌组织标本,癌旁组织标本以及正常结直肠标本。取1.5 cm×1.5 cm大小的标本,将标本离体后,立即置于冻存管中,随即存储于液氮罐中转移至实验室的-80 ℃冰箱直至进一步的使用(此次研究已经获得右江民族医学院伦理委员会的批准,编号为2023011601)。往1 mL高效RIPA中加入10 μL蛋白酶抑制剂 PMSF配制成RIPA裂解液(强),随即在研磨管中添加豌豆粒样样本和一颗6 mm磁珠,2颗3 mm磁珠以及400 μL配置好的裂解液。冰上裂解30 min,以12 000 r/min,4 ℃,离心15 min,取上清置于EP管中,用BCA试剂盒测定各组样品蛋白的浓度,加入5×蛋白上样缓冲液,沸水煮沸15 min,以30 μg蛋白浓度进行PAGE凝胶电泳,常规湿法转膜后,5%脱脂奶粉封闭2 h,分别用1∶10000的鼠抗兔单克隆抗体GAPDH、1∶5000的鼠抗兔单克隆抗体ABCA8的一抗4 ℃摇床孵育过夜,TBST洗涤3次,每次10 min,IgG-HRP标记的鼠抗兔二抗4 ℃摇床孵育2 h,TBST洗涤3次,每次10 min,后增强化学发光(ECL)显影。利用ImageJ软件进行灰度值分析,用ABCA8蛋白条带与GAPDH灰度值的比值计算各自的相对表达量。利用单因素方差分析进行癌组织,癌旁组织以及正常肠道组织三者之间的两两比较分析。

1.9ABCA8在HPA数据库中的表达情况 利用HPA数据库检索ABCA8在正常结直肠组织和结直肠癌组织中的表达。HPA数据库通过整合各种组织学技术,包括基于抗体的成像和转录组学,允许在线访问细胞组织和器官中的人类蛋白质图谱。

2 结果

2.1ABCA8基因在TCGA中的表达情况 通过对结直肠癌TCGA数据库中的数据进行分析发现ABCA8基因在正常肠道组织中的表达情况明显高于结直肠癌肿瘤(见图1A),且在配对差异分析箱线图中发现两者的数据差异明显(见图 1B),且样本数据分布规则。

注:A、B.TCGA数据库中ABCA8的表达差异;C.ABCA8和结直肠癌的预后并无相关性;D、E.ABCA8在TCGA数据库样本中和其他基因之间的相关性分析。

2.2ABCA8基因和结直肠癌的生存预后分析 通过生存分析发现,ABCA8高表达组和ABCA8低表达组中的生存预后差异无统计学意义(见图1C),说明ABCA8基因并不参与结直肠癌的预后。通过基因相关性分析发现在结直肠癌中ABCA8基因和多种基因之间存在着明显的关联(见图1D、图1E)。通过此分析认为结直肠癌发生时,ABCA8基因和多个基因之间存在明显的正相关作用,说明当ABCA8基因发生改变时,其相关的基因也会发生相应的变化。

2.3肿瘤微环境分析和免疫细胞浸润结果 利用R包estimateb包分析,发现根据ABCA8基因表达不同而分成的高低表达组中,基质打分(Stromal Score)/免疫打分(Immune Score)以及肿瘤微环境打分(ESTIMATE Sccore)均有差异(见图2A),且P<0.001。通过cibersort算法得到ABCA8基因和免疫细胞之间的免疫浸润结果,发现在ABCA8基因高表达组中(见图2B),幼稚B细胞/M2型巨噬细胞等的含量要高于ABCA8基因低表达组;但是,ABCA8基因低表达组中的CD8 T细胞/激活的CD4 记忆T细胞的含量要高于ABCA8基因高表达的组。且通过相关性分析发现ABCA8基因和记忆B细胞/静息NK细胞等呈负相关,和幼稚B细胞/M2巨噬细胞等呈正相关,且P<0.05(见图2C、图2D)。

注:A、B.ABCA8表达量高低分组之间的TME评分以及免疫细胞含量差异分析;C、D.ABCA8在TCGA数据库样本中和免疫细胞之间的相关性分析。

2.4免疫检查点相关分析 通过对免疫检查点相关基因以及ABCA8基因之间使用皮尔逊相关分析的方法进行循环比较,发现ABCA8基因和41个免疫检查点相关基因之间存在一定的关联,并且通过相关性热图进行展示(见图3A、图3B)。

注:A、B.ABCA8在TCGA数据库样本中和免疫检查点相关基因的相关性分析。

2.5Western Blot和HPA的结果 通过蛋白印迹实验发现在结直肠癌组织中ABCA8的表达水平低于癌旁组织(P<0.05),且低于正常组织(P<0.001),见图4A。通过HPA数据库发现ABCA8基因在结直肠癌组织中表达情况要明显低于正常结直肠组织(见图4B),其中在肠道组织中的黏膜淋巴细胞,成纤维细胞以及细胞质中ABCA8高表达,而在肿瘤组织中ABCA8的表达水平较低。

注:A.15例临床患者ABCA8的表达情况(a:癌组织,b:癌旁组织,c:正常肠组织)。

3 讨论

2020年,全球结直肠癌期的死亡人数为935 173例,而中国的结直肠癌死亡人数为286 162例,占比30.60%[10]。同时,在中国的结直肠癌的发病率也较高,仅次于食管癌和胃癌在消化道肿瘤的发病率[11]。由于结直肠癌早期由于症状不明显,通常为腹痛、大便性状的改变等[12],而这些往往并没有引起患者的重视,从而当患者确诊时,结直肠癌已经处于中晚期,而此时结直肠癌往往已经出现了转移。据统计,在中国2012年到2015年这四年期间确诊的结直肠癌患者的5年生存率仅为56.9%[13]。

通过对TCGA数据库的结直肠癌数据集中的ABCA8基因的分析,得到一系列具有价值的结果。ABCA8基因在健康样品和结直肠癌样品中存在显著的差异。此结果符合第一部分中利用GEO数据库中结直肠癌的样本分析的结果,ABCA8基因确实是在肿瘤样本中低表达,而在正常样本中高表达。已有文献表明[14],和ABCA8基因同源的ABCA3基因,ABCA1基因,ABCA2基因和多种癌症之间具有相关性。且当它们的表达被抑制时,皆会导致肿瘤的进展,这也间接说明ABCA8应该在肿瘤的发生发展中具有类似的作用。已有证据表明[6],ABCA1基因过表达后抑制结直肠癌肿瘤的增殖,而ABCA1基因沉默后促进结直肠癌细胞增殖,说明其在结直肠癌中是一种抑癌基因。从细胞分泌胆固醇的机制来看,ATP结合盒(ABC)A1具有不可忽视的重要作用。ABCA1位于细胞膜上,能够介导细胞内胆固醇等脂质的流出,从而启动胆固醇逆向转运降低细胞内胆固醇水平,若ABCA1表达的减少则会导致胆固醇和胆汁酸生成增多,二者进入大肠腔内后,以厌氧菌为主的大肠菌群可将其转变氧化胆汁酸等代谢产物,在体内转化为致癌物质,如脱氧胆酸和石胆酸等,从而对大肠隐窝上皮细胞产生细胞毒作用,并造成不可修复的 DNA 损伤[7,15-16]。

据相关文献报道[17],在正常乳腺上皮细胞内发现ABCA3和ABCA1的强烈表达,而在乳腺癌中低表达,且长期高胆固醇水平与患乳腺癌的风险增加有关。通过免疫检查点相关性分析发现ABCA8和CD28基因密切相关,具有正向调控关系。而有关文献表明CD28基因具有抗肿瘤的功能[18],故认为ABCA8的表达上调增加CD28的抗肿瘤作用,从而抑制肿瘤的发生。

在其他癌症中,ABCA8也和癌症的进展呈现一定的相关性。有相关文献表明[19],ABCA8基因在肝癌组织和细胞株中表达下调,其中ABCA8基因的表达与肝癌的进展及预后呈负相关。并且通过ABCA8是miR-374B-5P的直接靶点,抑制ERK/ZEB1信号通路。首次阐明了ABCA8在肝癌肿瘤中的作用,ABCA8有望成为一个新的治疗靶点。

目前,ABCA8和结直肠癌相关研究较少,与其同源的的蛋白已经被证实和肿瘤的发生发展具有密切关联[7,8,15-17],ABCA8是这个亚家族中一个鲜为人知的成员,最初是从人脑库中克隆出来的[20]。为了阐明ABCA8在结直肠癌中的作用,本研究利用TCGA数据库中的结直肠癌数据集以及Western Blot实验进行验证,从而发现ABCA8在正常肠道组织中表达明显高于结直肠癌组织中的表达,并且在HPA数据库中癌组织中的表达低于正常肠道组织,这也间接证明了生物信息学分析的结果,说明ABCA8的表达水平下调可能参与结直肠癌的发生。

综上所述,此研究通过生物信息学筛选结直肠癌关键基因并且通过临床病理组织的验证,发现ABCA8在结直肠癌组织中的表达水平明显低于正常肠道组织,故认为ABCA8可以作为一种新的诊断结直肠癌发生的生物标志物之一。