槟榔碱对口腔黏膜上皮细胞自噬和凋亡的影响

朱冰玉，蒋琪

口腔黏膜下纤维性变（OSF）是一种慢性炎症疾病，可影响口腔黏膜的任何部位，被认为是一种严重的潜在恶性口腔疾病。OSF 病理是以慢性炎症和萎缩性上皮为特征的病理损害，伴随结缔组织胶原纤维的异常堆积和血管狭窄或者闭塞为特征[1]。咀嚼槟榔已被认为是OSF 发病的主要病因，槟榔碱作为槟榔的重要成分之一，己经被证实是OSF 发病的主要病原性因素[2]。OSF 大鼠模型显示槟榔碱溶液长期局部应用导致上皮萎缩，成纤维细胞的增殖和胶原纤维的堆积，最终导致OSF[3]。口腔黏膜出现上皮萎缩后，黏膜的保护性屏障消失，槟榔碱等致癌因子容易渗入变薄的上皮，与上皮下层甚至基底细胞相互作用，使其发生恶变。

自噬和细胞凋亡是程序性细胞死亡（PCD）的两种形式，许多研究表明它们之间存在复杂的关系[4]。最近已有研究表明在槟榔碱处理的人口腔成纤维细胞中，自噬可通过上调TGF- 来诱导细胞胶原分泌增加[5]，但槟榔碱能否诱导OSF 中上皮细胞的自噬与凋亡目前仍不明了。角质形成细胞是上皮的主要构成细胞，数量占上皮细胞的80%以上，因此本研究检测槟榔碱对人口腔角质形成细胞（HOKs）中自噬相关蛋白LC3、P62 和凋亡相关蛋白Caspase-3 表达差异，以及细胞凋亡情况，探讨槟榔碱诱导HOKs 细胞自噬和凋亡的影响，并探讨其作用，为OSF 上皮组织病变的发病机制和治疗提供理论依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 实验细胞、试剂与仪器 HOKs 购于美国培养物保藏所（American type culture collection,ATCC），槟榔碱（购自美国Abcam 公司）、MTT（美国Sigma 公司）、兔抗人LC3 单克隆抗体和Caspase-3 兔抗鼠多克隆抗体（购自美国CST 公司）、兔抗人P62 单克隆抗体和-actin 鼠抗鼠单克隆抗体（购自美国proteintech 公司）、胎牛血清（购自美国Gibco 公司）、DMEM养基（购自美国HyClone 公司）、细胞凋亡检测试剂盒（购自江苏凯基生物）、BCA protein assay kit（购自美国Thermo Fisher）、细胞流式细胞仪（购自美国BD 公司）、SDS-PAGE 垂直电泳仪（购自美国Bio-rad 公司）。本研究经中南大学湘雅医学院医学伦理委员会审核通过。

1.2 细胞培养与传代 HOKs 在含有10%FBS、青霉素和链霉素的DMEM 培养基中培养，将HOKs 接种于培养基轻轻吹打混匀后，放入37 ℃、5%CO2和潮湿的培养箱中连续培养，随时注意细胞的生长状况。

1.3 MTT实验 将HOKs接种到96 孔培养板中并且每孔大约1×104个细胞。（1）加入含槟榔碱浓度分别为0、7.5、15、30、60 和120g/ml 的培养基，各组均设5 个复孔，培养24 h。（2）小心倒掉旧培养液，向每个孔中加入5 mg/ml MTT 和200l DMSO，分别在恒温箱中培养4 h。（3）记录490 nm 在酶标仪测量的吸光度。

1.4 评估不同时间槟榔碱对HOKs 的影响 实验分别用含15g/ml 槟榔碱培养液培养HOKs 至0、3、6、12 和24 h。

1.5 Western blot 检测LC3、P62 和Caspase-3 蛋白表达水平 各组HOKs 细胞用冰浴后的PBS 冲洗细胞2 次，用RIPA 裂解缓冲液提取总蛋白BCA 蛋白质测定试剂盒测定蛋白质浓度。经SDS-PAGE 电泳、切胶、转膜和封闭。用TBST 稀释抗体，分别按照LC3（1∶1000）、Caspase-3（1∶1000）、P62（1∶1 000）和-actin（1∶5 000）配制一抗，孵育1 ～2 h。然后将NC 膜与兔二抗（1∶6 000）和鼠二抗（1∶5 000）一起，室温孵育90 min。显色和曝光后通过Quantity one软件分析蛋白质的相对量，并将-actin设置为对照蛋白。

1.6 流式细胞术检测HOKs细胞凋亡 收集处理后的细胞（每组细胞数约1×105个），37 ℃下用离心机2 000 r/min 离心5 min。向每组样本中依次加入5l Annexin V-FITC 后，再加入5l PI 充分混合，在黑暗中反应15min。滴注200l 的Bindingbuffer，并在1h内使用BD FACSCalibur 流式仪检测细胞凋亡率。

1.7 统计方法 采用SPSS22.0 统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差表示，采用单因素方差分析（one-wayANOVA），P ＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度槟榔碱对HOKs 细胞活力的影响MTT检测发现槟榔碱以剂量依赖性方式抑制HOKs细胞活力，并且槟榔碱的抑制作用随着浓度的增加而增加。由于15g/ml 的槟榔碱处理的细胞显示出接近50%的抑制，因此该剂量用于进一步实验，见图1。

图1 MTT 法检测HOKs 细胞活力

2.2 HOKs自噬相关蛋白LC3 和P62 的表达 15g/ml的槟榔碱刺激HOKs，结果显示LC3-I 至LC3-II 转化水平随着时间的增加而上升（均P＜0.05），而P62的表达随着时间的增加而下降（P ＜0.05）。 -actin为阳性对照，0 h 为阴性对照，见图2。

图2 HOKs 自噬相关蛋白LC3 和P62 的表达

2.3 HOKs 凋亡相关蛋白Caspase-3 和cleaved Caspase-3 的表达 用15g /ml 的槟榔碱刺激HOKs，结果显示细胞中Caspase-3 和cleaved Caspase-3 的表达随着时间的增加而上升（P ＜0.05），见图3。

图3 HOKs 凋亡相关蛋白Caspase-3 和cleaved Caspase-3 的表达

2.4 HOKs 细胞凋亡率 0 h 组的细胞凋亡率为（3.64±0.65）%，3 h 组的细胞凋亡率为（3.98±0.84）%，6 h组的细胞凋亡率为（4.87±0.96）%，12h 组的细胞凋亡率为（6.23±1.35）%，24h 组的细胞凋亡率为（7.65±2.26）%，槟榔碱能够刺激HOKS 细胞发生凋亡，并且凋亡率随着时间的增加而上升（P ＜0.05），见图4。

图4 流式细胞术检测HOKs 细胞凋亡率

3 讨论

咀嚼槟榔习性是OSF 的主要病因，而槟榔碱是槟榔中含量最丰富的生物碱，对人口腔上皮细胞和成纤维细胞具有细胞毒性，能够增加DNA 链断裂，微核形成，提高基因突变和提高染色体畸变[6]。上皮组织作为口腔黏膜最外层的保护屏障，受到槟榔的长期刺激，首先引起上皮细胞的变化，受损的上皮细胞释放出多种细胞因子，通过一系列的信号转导途径使得成纤维细胞胶原蛋白分泌增加，胶原降解减少，从而导致纤维化形成。并且固有层胶原纤维堆积，将导致血管闭塞，加重上皮层缺血、缺氧和营养供给障碍，形成恶性循环[7]。本研究结果显示，随着槟榔碱浓度的增加，HOKs 的细胞增殖能力逐渐下降，进一步证实槟榔碱对上皮组织的损伤，促进了OSF 的发生发展。

凋亡，又称I型程序性细胞死亡，是机体清除衰老及异常细胞来维持组织器官稳定的过程[8]。在凋亡过程中，活化的半胱天冬酶（Caspase）能够切割多种底物，通过一系列的信号传导途径最终导致细胞凋亡的形态学变化[9]。Caspase-3 是其中最关键的蛋白酶，一旦通过外源性（死亡配体）和内源性（线粒体）途径被启动，凋亡便不可逆转[10]。本研究发现槟榔碱刺激HOKs后，凋亡相关蛋白Caspase-3 和cleaved Caspase-3 的表达及凋亡率均随着槟榔碱作用时间增加而逐渐上升，说明槟榔碱呈时间依赖性诱导HOKs细胞凋亡。Chang 等[11]研究也表明，槟榔碱通过阻滞S 期和G2/M 期的细胞来抑制上皮细胞的增殖，从而破坏上皮组织的修复过程。因此，笔者推测上皮细胞凋亡增加和抑制细胞增殖可能是上皮萎缩的潜在发病机制，而这一过程与槟榔碱的细胞毒性有关。

自噬，又称II型程序性细胞死亡，是对胞内异常大分子物质和细胞器的自我降解和再循环的过程，因此自噬对于维持真核细胞中的细胞代谢和体内平衡至关重要。最近的研究表明，自噬在上皮细胞的生存和死亡中起着关键作用，并且在纤维化相关疾病中受到越来越多的关注[12]。Li 等[13]的研究表明，自噬在OSF中起重要作用，抑制自噬可以促进成纤维细胞的凋亡，同时减少胶原纤维的合成。然而，自噬在OSF 上皮组织中的作用尚不明确。LC3 是形成自噬体必不可少的蛋白，Atg4 内肽酶切割LC3 以转变成LC3-I。在哺乳动物中，LC3-I 可以通过与磷脂酰乙醇胺偶联形成LC3-II，始终存在于自噬体的内外膜上[14]。P62 也是自噬标志性蛋白之一，具有多种细胞功能，对于细胞信号转导、蛋白质和细胞器的降解十分重要。P62 蛋白与泛素化的蛋白结合形成复合物，转运至自噬体中作为底物被降解[15]。当自噬发生时，自噬体中的P62 蛋白被降解减少，而自噬受到抑制时P62 逐渐累积增多。因此，本研究选用LC3 和P62 作为反应自噬活性的相关蛋白。Western blot 检测结果显示LC3-II/LC3-I 比率随着槟榔碱刺激时间的增加而增加，P62 的表达随着槟榔碱刺激时间增加而逐渐下降，说明槟榔碱呈时间依赖性诱导HOKs发生自噬。

自噬和细胞凋亡是生物体内两个重要的分解代谢过程，有助于维护细胞和组织的体内平衡。自噬是更新异常大分子物质和细胞器的主要机制，而细胞凋亡是将不需要的细胞胞内物质吞噬，并从生物体中消除的主要机制。尽管这两种途径之间存在显著差异，但它们在确定细胞命运方面具有高度相关性，既能够互相拮抗促进细胞生存，也能够互相协同共同促进细胞死亡[16]。本研究发现凋亡相关蛋白的表达及凋亡率均与自噬活性的表达相同，随着槟榔碱作用时间的增加而上升。着说明自噬和凋亡均与OSF发生发展相关，可能有协同作用。笔者推测槟榔碱长时间刺激口腔黏膜，导致更高的细胞毒性作用于外层上皮细胞，使得自噬活性升高，促进细胞显著凋亡。

总之，本研究表明槟榔碱可以诱导HOKs 的细胞凋亡和自噬，但确切的机制仍有待进一步研究。笔者认为研究槟榔碱对上皮细胞的自噬和凋亡对OSF的发病机制有重要意义，可以通过抑制自噬和凋亡从而缓解槟榔碱对上皮细胞的影响，为进一步探讨OSF 上皮萎缩的病因和治疗提供新的思路。