黄芩素抑制Toll样受体4/核因子-B炎症通路改善小鼠脑出血后脑损伤的作用及机制研究

王春喜，余永佳，黄立添，冯大勤

出血性脑卒中是最常见脑出血类型，占脑出血病例15%，却有50%卒中相关死亡，每年全球因此死亡约280 万人[1]。存活脑出血患者由于不可逆的神经损伤导致多数遗留残疾，仅20%左右在6 个月后具有功能独立性[2]。有证据表明，炎症反应导致神经细胞死亡及随后的神经功能障碍，在脑出血后脑损伤中起着关键作用[3-4]。脑出血多种裂解产物可刺激激活Toll样受体4（TLR4），启动核因子- B（NF- B）释放促炎子TNF- 及IL- 介导炎症反应，而抑制TLR4/NF- B 信号通路，可缓解脑出血后炎症反应，改善脑损伤[5]。黄芩素是从中药黄芩提取的主要生物活性成分，具有抗炎、抗氧化及抗凋亡等作用，是一种潜在的神经保护药物[6-7]。近年来，黄芩素在多种急性脑损伤模型中的神经保护作用得以证实[8-10]，其中也包括脑出血[11]，而其具体保护机制尚不完全清楚。最近研究显示，黄芩素可直接与TLR4 结合，从而靶向抑制TLR4 的激活[12]。本研究拟研究黄芩素抑制TLR4/NF- B炎症通路改善小鼠脑出血后脑损伤的作用与机制，报道如下。

1 资料与方法

1.1 动物 所有动物使用流程均符合美国国立卫生研究院的《实验动物护理和使用指南》。雄性C57BL/6J小鼠（10 ～12 周鼠龄，体质量20 ～25 g）购于南京大学，许可证：SYXK（苏）2019-0056。所有小鼠均被饲养在具有12 h黑暗-光照周期的环境，并可以自由获得充足的饲料和水。

1.2 仪器与试剂 黄芩素（98%纯度，Sigma公司），二甲亚砜（DMSO，Sigma 公司）；Ⅳ型胶原酶（Sigma公司）；TLR4、p65、p-p65 及二抗（Santa Cruz Biotechnology 公司），Iba1（Wako 公司），Alexa Fluor 二抗（Invitrogen 公司）；Fluoro-Jade C（FJC）染色试剂盒（Chemicon公司）；RIPA 裂解液、BCA 蛋白定量试剂盒、蛋白酶磷酸酶抑制剂、SDS-PAGE 凝胶配制试剂盒、ECL 化学发光试剂盒和5×loading buffe（r碧云天生物技术公司）；酶标仪、切片机（Thermo）；荧光显微镜（蔡司）；Western blot 电泳仪（Bio-rad）。

1.3 小鼠胶原酶诱导脑出血模型建立 根据文献[13]所述方法，通过基底节区注射Ⅳ型胶原酶来制作。小鼠通过吸入含有2%异氟醚100%氧气进行深度麻醉，并以1%异氟醚维持麻醉。麻醉成功后，将小鼠的头部被固定于立体定向器仪上，剪除头顶毛发，消毒后，中线处切开头皮以暴露前囟门，在前囟门后方1.0 mm 和右侧面2.5 mm 处颅骨上开一个1 mm 的孔，直到穿透硬脑膜。用27 号针头将IV 型胶原酶（0.06 U/0.5l 0.9%氯化钠注射液）注射到基底节区，深度为3.5 mm，注射完成后保持3 min 以防止脑脊液渗漏。骨蜡密封钻孔，缝合头皮。在37 ℃下观察小鼠从麻醉中恢复的30 min，小鼠完全苏醒后再放回温暖的笼子。通过盲法将动物随机分配到药物或溶剂治疗组，假手术组通过单纯注射0.5l 0.9%氯化钠注射液制作。所有的手术程序都是在上午9∶00-12∶00 进行。

1.4 分组及给药 将黄芩素溶解于DMSO保存，在药物注射前将其溶解于0.9%氯化钠注射液（最终黄芩素浓度为10 mg/ml，DMSO 含量为10%）。黄芩素通过腹腔注射。实验分为3 步：（1）根据前期研究[10]，使用3 种浓度的黄芩素（10、50 及100 mg/kg）来测试黄芩素对脑出血的神经保护作用。在脑出血后1、12 h 腹腔注射黄芩素（n=6），然后每12 小时注射一次黄芩素，持续3 d。在假手术组和脑出血组中，予同等体积的含10%DMSO 的0.9%氯化钠注射液。评估完神经功能缺损后，脑出血3 d 时进行深度麻醉，取各部分脑组织进行脑水含量测定。（2）小鼠（n=6）在脑出血诱导后6 或12h用黄芩素或溶剂进行治疗，然后每12 小时用黄芩素或溶剂治疗3 d。在评估神经功能缺损后，脑出血3d 时进行深度麻醉，取各部分脑组织进行脑水含量测定。（3）小鼠在脑出血诱导后1 和12 h 用黄芩素（50 mg/kg）或溶剂治疗，然后每12 小时给药1 次，持续3 d。对小鼠进行深度麻醉取脑组织，行Westernblot 检测目标蛋白表达（n=6）、组织学检测（n=3）和酶联免疫吸附试验（ELISA）（n=6）。

1.5 神经功能评分及脑水含量 使用改良的28 分神经系统评分[14]评估神经功能，分别于在手术前，脑出血后24、48 及72 h 进行。检测脑水含量采用文献[14]方法，小鼠在脑出血后72 h 行深度麻醉并立即取出脑组织并分成3 部分，包括同侧和对侧半球和小脑，小脑被用作参考。立即对它们进行称重以获得湿重，然后在100℃烤箱中干燥24 h 以获得干重。脑水含量=（[湿重—干重）/湿重]×100%。

1.6 FJC 染色及Iba1 免疫荧光 以血肿中心为中心点，前后间隔200m 进行冠状位进行冰冻切片。将冰冻切片浸泡在由1% NaOH 和80%酒精组成的碱性酒精溶液中5min，然后用70%的乙醇洗涤2min，随后在蒸馏水中洗涤2 min，将切片浸泡于0.06%高锰酸钾溶液中，摇床震摇10 min。用蒸馏水洗涤2次，然后在0.001%FJC 溶液中孵育10 min（避光）。然后用蒸馏洗涤2 次，风干，盖上载玻片，荧光显微镜观察。所有切片都在荧光显微镜下观察和拍照。

小胶质细胞的免疫组化检测，首先将冰冻切片使用PBS 清洗，接着使用10%正常山羊血清进行封闭后，用兔抗小鼠Iba-1 抗体在4 ℃下孵化过夜，然后在摇床上用PBS 洗3 次，每次10 min，然后用适当的二抗体Alexa Flour 594 在室温下反应1 h，然后用PBS 清洗。盖上载玻片，用荧光显微镜进行拍照。

在荧光显微镜下，由1 名对实验组分组不明的研究人员对血肿周围的四个区域而每个动物的三个切片进行观察和拍照。使用荧光显微镜在200 倍放大视野下对每个切片的四个区域中的FJC、Iba-1 阳性细胞进行计数，每只动物有3 个切片被计数。FJC和Iba-1 阳性细胞以细胞/200 视野面积表示。

1.7 Western blot 及酶联免疫吸附试验（ELISA）小鼠在脑出血后72 h 进行深度麻醉后处死，灌注后取血肿周围脑组提取蛋白后进行Western Blot检测，等量（40 g）的总蛋白在10%的SDS-PAGE 中电泳分离并转移到硝酸纤维素膜上。使用抗TLR4、抗p-P65、p65 和抗-actin 和恰当二抗体。使用ECL化学发光试剂盒对条带进行曝光，并使用Image J 软件（NIH）通过测量灰度值进行量化。结果以与-actin 的相对灰度表示，随后与sham组的平均值进行归一化。

根据说明书使用ELISA 试剂盒来量化TNF-和IL-1 的水平，根据标准曲线由一名对分组不知研究人员将测量的光密度值转换为浓度值。

1.8 统计方法 数据采用GraphPad Prism 8 软件分析，计量资料采用均数±标准差表示。多组间比较采用F 检验，多重比较采用LSD-t 检验。P ＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 黄芩素减少小鼠脑出血后神经功能缺损及脑水肿 小鼠脑出血模型中，黄芩素以浓度依赖的方式改善了神经功能障碍并减轻了脑水肿。脑出血后1h用50 或100 mg/kg 的黄芩素治疗，均可明显减轻神经功能障碍，并在脑出血后72 h 时明显减少同侧半球的脑水肿（均P ＜0.05），见封三彩图1。

图1 黄芩素治疗可缓解小鼠脑出血后3d神经功能缺损及脑水肿(与脑出血组比较,*P<0.05,**p<0.01)

脑出血后延迟到6 h 予黄芩素治疗仍能减少神经功能障碍以及减少脑出血后72 h 同半球的脑水肿，见封三彩图2。脑出血后12 h 才开始予黄芩素治疗组，可见在脑出血后3 d有减少神经功能障碍和脑水肿的趋势，但差异无统计学意义（P ＞0.05）。

图2 黄芩素(50mg/kg)治疗小鼠脑出血的时间窗(与脑出血组比较，*P<0.05)

2.2 黄芩素抑制脑出血后神经细胞退变 在假手术组中检测到少量FJC 阳性细胞。在脑出血组，FJC阳性细胞与假手术组相比明显增加，而黄芩素治疗后FJC 阳性细胞明显减少，见图1。

图1 黄芩素治疗减少小鼠脑出血3 d 时神经细胞退变（与假手术组相比，***＜0.001；与脑出血组比较，###＜0.001）

2.3 黄芩素抑制脑出血后小胶质细胞激活 在假手术组，脑内检测到较少的Iba-1 阳性细胞，脑出血组的小胶质细胞被急剧激活，而黄芩素治疗明显减少了脑出血后3d血肿周围区域的激活小胶质细胞的数量，见图2。

图2 黄芩素治疗减少小鼠脑出血3 d 时小胶质细胞激活（与假手术组相比，***＜0.001；与脑出血组比较，###＜0.001）

2.4 黄芩素抑制脑出血后TLR4/NF- B 的激活Western blot 结果显示，在假手术组脑内TLR4 及pp65 蛋白表达水平均较低，而与假手术组比较，脑出血后血肿周围脑组织TLR4 及p-p65 蛋白表达水平明显升高，黄芩素治疗后显著减少脑出血后TLR4 及p-p65 的表达，见图3。

图3 黄芩素治疗降低了小鼠脑出血3 d 后TLR4 及p-p65 的表达（与假手术组相比，***＜0.001；与脑出血组比较，#＜0.05）

2.5 黄芩素减少了脑出血后损伤脑组织中促炎症因子的产生 假手术组的TNF-a和IL-1 的浓度较低，脑出血后急剧增加，用黄芩素治疗后，它们大大减少，见图4。

图4 黄芩素治疗降低了小鼠脑出血3 d时促炎因子（TNF- 和IL-1 ）（与假手术组相比，***P ＜0.001；与脑出血组比较，#P ＜0.05，##P＜0.05）

3 讨论

本研究发现黄芩素在小鼠胶原酶诱导脑出后脑损伤中起着保护作用，进一步机制研究发现，黄芩素的神经保护作用可能是通过抑制TLR4/NF- B 介导的炎症通路及小胶质细胞活化所介导的。

脑出血原发性损伤主要是血管破裂后血液进入脑实质形成血肿，导致的机械性损伤，由于其难以预见，因此潜在的干预策略是非常有限的[15-16]。临床主要针对继发性脑损伤进行干预，而继发性脑损伤主要是由于血液及其裂解产物产生的一系统复杂的反应导致的。其中脑出血后脑内的炎症反应在脑出血后继发性脑损伤中起着至关重要的作用[3-4]。炎症通路的激活导致神经细胞死亡、小胶质细胞活化及脑水肿等，因此炎症反应是脑出后继发性脑损伤的关键治疗靶点[17]。本研究也是针对脑出血后的炎症反应，从天然药物中寻找潜在的神经保护剂。

黄芩素在包括阿尔茨海默症、帕金森、缺血性卒中等多种神经系统疾病中起着神经保护作用[6-7]。本研究首先在胶原酶诱导的脑出血模型中，通过腹腔注射不同浓度的黄芩素（10、50 及100 mg/kg）评估了黄芩素的神经保护作用。研究发现，在小鼠脑出血模型中，经腹腔注射黄芩素可减轻神经功能缺损及减少脑水肿，并呈现出剂量依赖性。在其他脑出血研究中也得到证实[11]。此外，本研究还进一步探讨了选择中剂量的黄芩苷（50 mg/kg）在小鼠脑出血模型中的治疗时间窗，小鼠在模型诱导后不同时间点（6 及12 h）使用对照溶解或者黄芩素进行治疗，发现模型诱导后6 h 使用黄芩素仍能缓解神经功能缺损及减轻脑水含量，12h 后治疗后有改善趋势。这表明在胶原酶诱导小鼠脑出血模型中，黄芩素的治疗时间窗可以拓展到出血后6h，然而其具体的保护作用仍不明确。

由于小胶质细胞作为中枢神经系统的固有免疫细胞，在脑出血后被激活后释放炎症因子，加急神经炎症，导致脑出后脑损伤[18]，并且黄芩素在多种体内体外模型中抑制小胶质细胞活化及炎症因子释放[19-20]。本研究发现，使用黄芩素治疗后，脑出血受损伤的脑组织中小胶质细胞激活减少，表明黄芩素可通过减少小胶质细胞激活减少脑出血所诱导的神经炎症。此外，通过FJC染色显示，经过黄芩素治疗的小鼠血肿周围变性神经细胞想到减少，表明黄芩素可以保护神经细胞免受脑出血引起的脑损伤。这些结果表明，抑制小胶质细胞的激活和神经细胞的变性可能是黄芩素发挥其神经保护作用的机制。

TLR4 在调控小胶质细胞活化及神经炎症中起着至关重要的作用[21]，TLR4 作为一种损伤相关分子模式受体，在脑出血后多种被几个具有损伤相关分子模式的内源性配体（如血红蛋白和纤维蛋白原）激活，随后激活其下游转录因子NF- B，增强促炎症细胞因子的产生，从而诱发先天性免疫反应而导致神经功能缺损[22]，因此TLR4/NF- B 是脑出血后治疗脑损伤的关键靶点。而笔者在蛛网膜下腔出血模型中证实黄芩素可抑制TLR4/NF- B 通路介导的神经炎症反应，缓解早期脑损伤[10]，其他研究者在脑缺血中也观察到相似结果[23]。更有研究表明黄芩素可直接与TLR4 结合，从而靶向抑制TLR4 的激活[12]。本研究观察到黄芩素治疗后，可抑制脑出血后TLR4 的表达以及NF- B（p65）的磷酸化，从而减少下游促炎症因子（TNF- 及IL- ）的释放。这些结果提示黄芩素可抑制脑出血后TLR4/NF- B 通路介导的炎症反应。

综上所述，黄芩素可以保护脑出血引起的脑水肿，并改善脑出血后的神经功能；并进一步证明，黄芩素保护脑出血导致神经细胞退变的影响。此外，黄芩素通过抑制小胶质细胞激活、TLR4/NF- B 通路介导促炎因子（TNF- 及IL- ）的释放而发挥了抗炎作用。