阿伐那非及其有关物质研究进展

吴小霞, 赵梦梦, 刘 虎, 孙允凯,3*

(1. 南华大学 化学化工学院,湖南 衡阳 421001; 2. 嘉实(湖南)医药科技有限公司,湖南 长沙 410220; 3. 常州工学院 化工与材料学院,江苏 常州 213032)

勃起功能障碍(ED)作为成年男性常见的性功能障碍之一,是指无法达到或维持足够的勃起而产生的令人满意的性行为[1],表现为一种对生活质量有显著负面影响的现象。ED影响了世界各地数以百万计人的性生活及其妻子身心福祉和生活质量[2]。研究表明,加拿大存在40%的成年男性患有勃起功能障碍,而美国大约有1000～3000万男性患有不同程度的ED[3]。2021年中国卫健委调查数据显示,我国成年男性ED总体患病率高达40.5%。 ED的理想治疗方法应该体现在易于给药、无创、不疼痛、高效和副作用小等方面[4]。由于人类早期对勃起的基本生理生化机制了解有限,可采取的治疗方法主要包括心理和激素策略,以及阴茎植入物和真空装置的使用等。随着人们对勃起机制的深入了解,研究人员开发了体内注射和口服5型磷酸二酯酶(PDE5)抑制剂的策略。其中,口服PDE5抑制剂彻底改变了ED的治疗方式,并因其有效性和良好的安全性成为一线治疗方法[5-6]。

PDE5抑制剂在男性勃起功能障碍等疾病中具有广泛应用。欧洲药品局批准了3种治疗ED的PDE5抑制剂[7],即西地那非、他达拉非和伐地那非。BOOLELL[8]最早提出用西地那非来治疗男性勃起功能障碍,使其成为第1个用于治疗男性勃起功能障碍的PDE5抑制剂[9]。该抑制剂经肠道迅速吸收,可在30～60 min后起效,1 h内达到峰值血浆浓度[10],半衰期(t1/2)为3～5 h,作用时间最长可达12 h[11]。西地那非虽然可以有效地改善勃起功能,但其与PDE6受体存在一些交叉反应性,而PDE6受体存在于视网膜光感受器中,因而会导致一些患者的色觉异常[12-13]。由于西地那非可经肠道吸收,若食用脂肪含量高的食物会减少其吸收,从而延长作用时间。在西地那非的研究基础上,又推出了伐地那非和他达拉非,两者均于2003年批准上市。伐地那非在给药30 min后起作用,1 h内达到峰值血浆浓度,t1/2为4～5 h[14-15]。虽然伐地那非作用效果是西地那非的10倍,但高脂肪的食物同样会降低其效果[16]。他达拉非在给药30 min后有效,2 h内达到峰值血浆浓度[17]。然而,他达拉非的t1/2为17 h,因而其药效作用持续时间长达36 h,且疗效不受脂肪摄入量的影响[18]。他达拉非与PDE11有一定的交叉反应,同样会给患者带来副作用。之后研究人员又陆续开发了3个其他PDE5抑制剂:乌地那非[19](udenafil),米罗那非[20](mirodenafil)和阿伐那非。

阿伐那非作为治疗男性勃起功能障碍的高效PDE5抑制剂,其安全性受到了人们的广泛关注。除了定量药物外,还必须了解药品中杂质的来源和控制方法。研究人员开发了许多检测药品中PDE5抑制剂含量的方法,包括TLC和HPLC-PDA-MS[21]、 LC-ESI-MS/MS[22]、 LC-QTOF-MS[23]以及LC-MS/MS[24]等。为了满足各药物监管机构的要求,阿伐那非用药限度应控制在毒理学的门槛以内[25]。合成药物中的杂质主要源于起始底物、试剂、溶剂和副反应,其次在温度、湿度和光照等因素影响下,药品质量会随时间发生变化,因而药品稳定性测试是药物审批过程中评估药品质量的重要步骤。本文对阿伐那非合成过程中确定的有机杂质和阿伐那非的降解产物及控制分析方法进行总结,以便开发出更优的鉴定表征和控制阿伐那非有关物质限度的方法。

1 阿伐那非概述和合成

1.1 阿伐那非概述

阿伐那非(avanafil),化学名为(S)-4-((3-氯-4-甲氧基苄基)氨基)-2-(2-(羟甲基)-1-吡咯烷基)-N-(2-嘧啶基甲基)-5-嘧啶甲酰胺,分子式为C23H26ClN7O3,商品名为Stendra,是由三菱田边制药公司开发的一种cGMP特异性PDE5抑制剂,于2012年经美国FDA批准上市。药品呈椭圆形、为刻有规格的淡黄色片剂,规格有50 mg、 100 mg和200 mg[26]。实际上,该药品是一种白色的结晶粉末,可溶于甲醇和乙腈而几乎不溶于水,可溶于0.1 mol/L盐酸,pKa值为9.04。体外研究表明,阿伐那非对PDE5的选择性比对其他已知的磷酸二酯酶的选择性高,起效更快[27-28],副作用更少[29],因此,阿伐那非作为新型药物,具有良好的市场前景。

1.2 阿伐那非的合成

迄今为止,许多文献[30]报道了阿伐那非的合成路线。YAMADA课题组[31]最早提出了阿伐那非的制备过程(图1)。该过程主要为:3-氯-4-甲氧基苄胺(SM1)与4-氯-2-(甲硫基)嘧啶-5-甲酸乙酯(1)发生亲核取代反应合成4-(3-氯-4-甲氧基苄基氨基)-5-乙氧基羰基-2-甲硫基嘧啶(2);化合物2被氧化得到氧化产物4-(3-氯-4-甲氧基苄基氨基)-5-乙氧基羰基-2-甲基亚磺酰基嘧啶(2),化合物2与L-脯胺醇(SM2)发生亲核取代反应生成(S)-4-(3-氯-4-甲氧基苄基氨基)-5-乙氧基羰基-2-(2-羟甲基-1-吡咯烷基)嘧啶(4);化合物4经水解后得到化合物(S)-4-(3-氯-4-甲氧基苄基氨基)-5-羧基-2-(2-羟甲基-1-吡咯烷基)嘧啶(5);化合物5与2-氨甲基嘧啶(SM3反应制得阿伐那非。该合成方法所需试剂较多,操作工序和反应条件复杂,反应时间较长,产品收率不高。目前主流工业化生产是在该合成路线的基础上,改变水解和取代的先后顺序,可有效避免外消旋化,提高阿伐那非的产率和纯度。

图1 YAMADA[31]的阿伐那非合成路线

基于YAMADA课题组的阿伐那非制备方法,我国研究者对其进行了改进。2013年,许学农[32]在其专利中报道了阿伐那非的合成路线(图2)。将6-氨基-1,2二氢嘧啶-2-酮-5-甲酸乙酯(6)与SM1反应生成6-((3-氯-4-甲氧基苄基)氨基)-2-酮-1,2-二氢嘧啶-5-甲酸乙酯(7);化合物7被SM2发生亲核取代后,得到化合物(S)-4-((3-氯-4-甲氧基苄基)氨基)-2-(2-(羟甲基)吡咯烷-1,2-二氢嘧啶-5-甲酸乙酯(8),化合物8水解后再与SM3反应制得阿伐那非。该路线符合绿色化学的原子经济性理念,操作工序简洁。但由于化合物6不属于大宗工业化原料,导致制备阿伐那非的成本较高,且中间体8易水解,会使手性片段发生外消旋化,降低阿伐那非收率和纯度。此外,许学农[33]还报道了一种以胞嘧啶(Cytosine)为起始原料,经过取代、缩合以及卤代加成制备阿伐那非的方法。该法虽然原料易得,工艺简单,但其卤代试剂为液溴,当采用含镍化合物做催化剂时,液溴和含镍催化剂的使用会增加实验安全风险且引入元素杂质,不利于工业生产。

图2 许学农[33]的阿伐那非合成路线

2014年,程晓峰等[34]开发了一条适合工业化生产的阿伐那非合成路线(图3)。将化合物1和SM1作为原料,经反应得到化合物2;将化合物2水解后得到6-((3-氯-4-甲氧基苄基)氨基)-2-(甲硫基)-1,2-二氢嘧啶-5-甲酸(9);化合物9与SM3反应得6-((3-氯-4-甲氧基苄基)氨基)-2-(甲硫基)-1,2-二氢嘧啶-N-嘧啶-5-甲酰胺(10);之后经m-CPBA氧化后得到6-((3-氯-4-甲氧基苄基)氨基)-2-甲基亚磺酰基-1,2-二氢嘧啶-N-嘧啶-5-甲酰胺(11);化合物11与SM2反应得到阿伐那非。与YAMADA课题组和许学农的合成路线相比,该合成路线采用先水解后酰胺化再进行取代的方法,可有效避免消旋化产物的生成,提高了反应的产率。

图3 程晓峰[34]的阿伐那非合成路线

2015年,PRADHAN课题组[35]报道了一种通过在极性溶剂中还原(4-((3-氯-4-甲氧基苄基)氨基)-5-((嘧啶-2-基甲基)氨基甲酰基)嘧啶-2-基)-D-脯氨酸(12)来制备阿伐那非的方法(图4)。起始物1和SM1发生取代反应生成化合物2,化合物2水解成酸后与SM3反应生成化合物10,经氧化后再与D-脯氨酸(SM4)反应得化合物12。该路线得到的阿伐那非纯度高且产率高,其制备过程简单,利于工业化生产。

图4 PRADHAN[35]的阿伐那非合成路线

2016年,李志强等[36]提出了一条新的阿伐那非合成路线(图5)。化合物4-氯-2-(甲硫基)嘧啶-5-甲酰氯(13)和SM3在-10～5 ℃反应条件下生成化合物4-氯-2-(甲硫基)嘧啶-N-(-2-甲基)嘧啶-5-甲酰胺(14);之后在0～3 ℃条件下,将化合物14与SM1反应得到化合物10;最后将化合物10与SM2在室温条件下反应18～20 h得阿伐那非。该合成方法反应步骤少,产品收率高,但起始物料为非大宗化学品,将使成本升高。

图5 李志强[36]的阿伐那非合成路线

2018年,杨虎星等[37]提出了一种阿伐那非的制备方法(图6)。以甲基硫脲硫酸和乙氧亚甲基丙二酸二乙酯为初始原料,依次经过环合、氯化反应得到化合物1;将化合物1与3-氯-4-甲氧基苄胺SM1进行取代、水解后得化合物9;将化合物9与SM3反应得到关键中间体10,化合物10经氧化后与SM2反应生成阿伐那非。该路线具有原料易得、操作简便,反应条件温和,产品收率较高的优点。

图6 杨虎星[37]的阿伐那非合成路线

汤俊等[38]提出了改进的阿伐那非合成路线(图7)。将4-[(3-氯-4-甲氧基苯基)甲氨基]-2-[(S)-2-羟甲基吡咯-1-基]嘧啶-5-羧酸和2-氨甲基嘧啶经硼酸卟啉催化反应后得阿伐那非。反应结束后目标产物与催化剂易于分离,大大降低了后期产物分离提纯的难度,回收的催化剂可以循环利用,整个催化反应具有简单、绿色等特点。

图7 汤俊[38]的阿伐那非合成路线

2 阿伐那非及其有关物质检测

2.1 有关物质的定义及影响

有关物质是指化学结构与活性成分类似或具有渊源关系的有机杂质,包括副反应产物、中间体、聚合体、起始原料和贮藏过程中的降解产物等[39]。中国药典上详细记录上市药物的检测方法和限度,其中有关物质的检测是关键性的研究项目之一。而杂志的检测需要结合药品的工艺过程和结构特点来进行分析,从而检测出可能的杂质来源,同时将杂质控制在一个安全、合理的限度范围内[40]。通过杂质谱分析掌握药品杂质的概貌,可评估杂质的风险水平,并建立有针对性的分析方法,从而尽可能检测出各种潜在的杂质[41]。而对药物的降解进行研究,能实现从杂质产生的源头方面主动把控药品杂质风险,保证对药品质量的有效控制。阿伐那非结构具有酰胺、芳基氯和羟基等官能团,因而在水解过程中很容易变为有毒的降解物。根据ICH指南Q1A(r2)的要求,必须对阿伐那非及其有关物质进行彻底的化学稳定性研究,进而开发出适合阿伐那非高效、灵敏的控制分析方法。

2.2 高效液相色谱(HPLC)法

高效液相色谱(HPLC)是鉴别、量化和分离混合物成分最常用的技术[42],其在药物分析的应用中为治疗性药物监测和临床研究提供了一个强有力的工具[43-44]。近年来,研究人员开发了一系列的阿伐那非及其有关物质的检测分析方法。例如,HEGAZY[45]建立了灵敏、简单的反相HPLC法,并以他达拉非作为内标测定的同时对其进行了验证。在EclipseC18柱(150.00 mm×4.60 mm, 5.00 μm粒径)的运行时间内,使用流动相为乙腈:0.15%三乙胺(40 ∶60,V∶V),在7.0 min内实现了分离。分析阿伐那非在1.00 mL/min的流速下的荧光效果,检测值为236/370 nm,达泊西汀的荧光检测为236/410 nm。通过天然荧光测定,阿伐那非和达托霉素的响应值在0.05～40.00 μg/mL和0.01～30 μg/mL的范围内呈线性变化,检测限分别为0.043 μg/mL和0.007 μg/mL。

KUMAR课题组[46]提出了一种测定阿伐那非片中降解物和已知杂质的稳定性指示HPLC方法。阿伐那非片在酸、碱、氧化、光热和潮湿条件下会观察到明显降解。通过对不同条件下阿伐那非的降解产物用RP-HPLC进行分离纯化,在45 ℃时,采用惯性ODS3柱(3.00 μm, 4.60 mm×250.00 mm)。流动相A为0.10%三氟乙酸和三乙胺水溶液,流动相B为水和乙腈(20 ∶80,V∶V)。采用1.2 mL/min梯度的洗脱模式,并在245 nm处记录峰值响应,最终得到了较好得分离色谱图。虽从已知杂质中观察到了分离出的降解物,但降解产物峰未较好地分离。该方法具有特异性、精确、稳健和线性,是一种准确测定杂质含量的稳定性指示方法,可用于生产样品时常规分析以及杂质含量检测。

2022年,本课题组[47]提出了一种新的稳定梯度超高效液相色谱法(UPLC),检测了多个实验室批次中含量为0.29%～1.63%的4种杂质(图8),并且首次报道了Imp-D的合成路线。该UPLC方法采用HSSC18(50.00 mm×2.10 mm,粒径1.80 μm)柱,柱温35 ℃,流动相组成为甲酸铵(20.00 mM)和乙腈,采用梯度洗脱,检测波长为239.00 nm。结果表明,该方法有很好得特异性、线性度、精密度、准确性和灵敏度,获到的色谱也说明该方法对阿伐那非和有关物质优异的分离效果,符合监管机构要求的质量控制限度。

图8 Imp-A、 Imp-B、 Imp-C和Imp-D的结构

2.3 基于QbD的HPLC法

(1) QbD用于HPLC药物分析方法的建立

质量源于设计(quality by design, QbD)的概念是在人们将所有潜在风险融入到药物研发和设计中而产生的。ICH Q8中明确指出QbD可用于新药分析方法的建立和评估[48]。HPLC因其强大的分离能力而成为药物分析强有力的工具,对于针对不同药物而建立的HPLC法,需要对分析方法进行验证并考察专属性、线性、精确度和准确度等。而考察这类特性一般在研究的最后阶段,同时需要投入大量的人力及物力。QbD便可用于解决此种问题,用风险管理的过程质量控制方法,将潜在风险融入到最初阶段,从源头解决问题。随着QbD理念的引入及应用,研究者们已开始逐步在分析方法开发中运用QbD的理念[49]。

(2) 基于QbD的HPLC法检测阿伐那非制剂

KOTHARI课题组[50]开发了用于检测二元混合物和剂型中的阿伐那非和达泊西汀的多元紫外分光光度法和基于QbD的HPLC法,同时还提出了4种测定药片中阿伐那非和达泊西汀的化学计量辅助方法(CLS、 PLS、 PCR和NPLS)。实验过程中采用Box-Behnken设计优化了4个关键变量,即设计了1个实验程序,揭示流动相比、温度柱烘箱温度、流速和pH对目标药物的峰面积、对称性、分辨率和保留时间的影响。该HPLC法虽能高效准确的测出药片中的阿伐那非的含量,但却无法测定降解产物以及阿伐那非中的杂质。

PATEL等[51]报道了一种基于QbD法的详细稳定的HPLC-PDA方法。应用系统QbD方法,通过筛选和优化来推导阿伐那非全面的化学稳定性。主要参数筛选采用石川图和风险评估方法,并通过中心复合设计(CCD)优化了4个关键因素:C18柱(250.00 mm×4.60 mm, 5.00μm),流动相为10mM醋酸铵缓冲液:ACN(60 ∶40,V∶V), pH为4.5,流速为0.90 mL/min,柱温为20 ℃,从而获得不同条件下阿伐那非的降解峰。阿伐那非的化学稳定性研究表明,在氧化、热和酸碱性条件下阿伐那非容易降解。该方法有利于药物在合成、保质期和有效期确定期间的药物质量管理。

2.4 LC-MS法

(1) LC-MS/MS方法

液相色谱-质谱联用技术(LC-MS)作为高效的分离鉴定分析方法,在有机合成、药物分析和生物蛋白酶等方面有着重要的作用。PONTAROLO课题组[52]开发和验证了一种基于LC-MS/MS的新的生物分析方法,可以同时测定6种人血浆中PDE5抑制剂(阿伐那非、洛地那非、西地那非、他达拉非、乌地那非和伐地那非)的含量。该方法采用XbriceC18柱,柱温为40 ℃,以水和乙腈作为流动相(甲酸和甲酸铵)并按梯度模式进行分离。用乙醚提取人血浆,以磺基喹恶啉作为内标,得到完全分离的色谱。根据目前的指南,对该方法进行了验证,发现PDE5抑制剂具有选择性、线性且精确、无残留和无基质效应,但该方法只能测定PDE5抑制剂的含量,不能检测其他杂质。

PATEL等[53]针对阿伐那非开发了一种新型的LC-MS/MS兼容方法,鉴定和表征了其降解产物。根据LC-MS/MS产生的碎片离子数据,解析了16种降解产物的结构(图9),进一步提出了阿伐那非在酸、碱性、氧化、光解和热降解条件下的合理降解机制,从而表明其降解是由亲核取代反应和酰胺水解引起的。从结构上可以看出,酰胺基容易水解,而芳基氯和氢氧基易发生光分解。该方法虽能分析阿伐那非的降解杂质并解析其结构,但降解产物的分离效果不是很理想。

图9 16种降解产物的结构

(2) LCMS-IT-TOF法

CAN等[54]采用LC-DAD、 LC-MS/MS和LCMS-IT-TOF测定了药物制剂中阿伐那非含量并对其降解产物做定性分析,鉴定新型降解产物。LC-DAD或LC-MS/MS技术均可以用于阿伐那非及其降解产物和达泊西汀的无干扰测定,同时可用于QC实验室的常规分析。当采用LC-DAD和LC-MS/MS仪器时,该方法可分别在11.80 min和12.60 min范围内检测和定量阿伐那非。而采用LCMS-IT-TOF法首次鉴定出了在氧化条件下产生的新型降解产物(图10)。阿伐那非的检测时间约为14.70 min,而已知降解物Imp-E和Imp-F以及新的降解产物Imp-G的保留时间分别为13.30、 20.50和33.50 min,因此,LCMS-IT-TOF在新的降解产物的研究中具有优越性。

图10 Imp-E、 Imp-F和Imp-G的结构

(3) LC-QQQ-MS法

由于阿伐那非在长期给药后仍存在副作用,因此有必要对其药代动力学和生物利用度参数进行研究。KAMMOUN课题组[55]建立了一种灵敏的高效液相色谱-三重四质谱法(LC-QQQ-MS),用于分析大鼠血浆和大脑中的阿伐那非。研究者建立、优化了液-液提取方法,并用于从血浆和脑匀浆中最大限度地回收阿伐那非。在NuncledurC18柱上进行分离,流动相由0.10%甲酸和乙腈(29 ∶71,V∶V)组成,流速为0.5 mL/min,采用QqQ-MS应用正多反应监测模式进行监测,最终得到分离完全的色谱。该方法性能良好,并成功地应用于大鼠血浆和脑组织匀浆中阿伐那非及相关代谢物的定性和定量分析,测定得到单剂量口服和经皮应用后其在大鼠血浆和脑组织中的药代动力学参数。

HPLC、 LC-MS/MS、 LCMS-IT-TOF和LC-QQQ-MS等方法都能对阿伐那非与有关物质的含量进行准确检测,并通过质谱数据进行结构解析。在探寻这些分析方法最优色谱条件的过程中,除了传统的对照分析实验外,研究人员还结合化学计量辅助方法,通过设计实验程序去揭示流动相比、柱温、流速和pH对峰面积、对称性、分辨率和保留时间对阿伐那非与有关物质检测过程的影响。高效液相与其他技术联用的方法不仅能够准确定量阿伐那非和有关物质,同时对有关物质结构特征和阿伐那非降解原理有了更深入的了解。

本文简述了阿伐那非的合成工艺路线,论述近年来研究人员对合成路线的改进,并开发了针对阿伐那非及其有关物质的检测分析方法。HPLC法与基于QbD的HPLC法,能够准确测出阿伐那非的含量;稳定性指示HPLC法,能从杂质中清楚观察到降解物;HPLC-PDA法成功分离出在不同降解条件下的降解物。研究人员开发了各种高效液相与其他技术联用的分析检测方法,通过LC-TOF-MS法,鉴定阿伐那非的有关物质和降解产物峰;用LC-MS/MS法成功分离阿伐那非在酸、碱性、氧化、光解和热降解条件下的多种降解物,并解析了降解产物的结构;通过LC-QQQ-MS法,测定了阿伐那非给药后的药代动力学参数等。HPLC与其他技术的联用作为高效的分析方法,将在药物分析发展中发挥更加重要的作用。针对不同药物建立高分辨、超微量的分析方法,保证药品质量和用药安全,促进原料药研发质量水平的提高。