新型水溶性吲哚花箐的合成及光谱性能研究

陈正军, 丁尚丽, 吕佳佳, 杨明焱, 高 杰, 李洪玉, 罗俊俊, 袁泽利

(遵义医科大学 药学院,教育部基础药理重点实验室,贵州省生物催化与手性药物重点实验室,贵州省医用光学诊疗技术与创新药物国际科技合作基地,贵州 遵义 563000)

肿瘤微环境中原癌基因在某些诱发因素作用下表达,生成结构和功能异常的血管和淋巴管,并造成以缺氧和酸中毒为特点的新陈代谢环境[1]。肿瘤在缺氧条件下,缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α)将被激活并增强有机阴离子转运多肽(organic anion transporting polypeptides, OATPs)的表达,OATPs在大多数类型的癌细胞中过表达,并介导两亲性药物或激素,甚至促进外源性底物的摄取[2]。一些两亲性分子成为缺氧条件下OATPs表达的靶向肿瘤诊疗试剂[3-4]。因此,设计合成具有肿瘤靶向的两亲性分子成为肿瘤诊疗剂开发的热门研究方向之一。

七甲川花菁类化合物是一类两端氮杂环中间含有多个次甲基长共轭链的花菁小分子,通过分子设计,已经有众多的两性花菁分子被设计合成[5-7]。这类分子的吸收和发射波长处于近红外区,且摩尔吸光系数大,可有效避免生物检测中待测物荧光背景的干扰,使其在医学成像领域具有潜在的应用价值[8-10]。因而七甲川花菁类化合物已经被广泛用于蛋白与核酸标记、动物活体成像以及临床造影等的生物医药研究[11-13]。其中,代表性分子吲哚菁绿(indocyanine green, ICG),已经在临床上广泛用于心脏、肝脏和眼底血管显影等。随后研究发现,ICG在含盐的缓冲溶液中因易聚集导致荧光强度减弱,且该分子光稳定性差而影响临床深入应用[14-16]。为获得生理条件下光学性能优异的吲哚花箐染料,研究者利用ICG分子中多甲川链设计,在链中引入环烃基团,得到了稳定性显著提高的吲哚花箐染料IR780(图1)。研究表明,由于环烃基使分子的刚性和空间位阻增大,不利于单线态氧的进攻,提高了IR780的光稳定性[15-17]。然而,该分子在含盐缓冲液中溶解度差,限制了其在生物医药应用研究。

图1 ICG和IR780的结构

为获得水溶性好的IR780吲哚花箐染料,本文基于IR780母核,用季铵盐在吲哚上进行取代,增强其水溶性;用芳环取代环烃基氯,增强分子刚性和空间位置,得到3个新型水溶性吲哚花箐染料分子(图2),其结构经1H NMR、13C NMR和HR-MS表征,并对中间体(3)及目标染料(4～6)的光谱性能进行了初步研究。

图2 化合物4、 5和6的合成路线

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Agilengt 400DDR型核磁共振波谱仪(TMS为内标,CD3OD为溶剂);TU-1901型紫外-可见吸收光谱仪;Carry Eclipse型荧光光谱仪;Aglient 6550qtof &Thermo Fisher-QE型高分辨质谱仪。

环己酮、芳基硼酸、N,N-二甲基甲酰胺和三溴丙基三甲基溴化铵均购自上海萨恩化学技术有限公司;2,3,3-三甲基-3H-吲哚、柱层析硅胶和氧化铝均购自上海泰坦科技股份有限公司。其他试剂均为分析纯。

1.2 吲哚花箐染料(4～6)的合成

(1) 3-(羟基亚甲基)-2-氯环己-1-烯(1)的合成

参照文献[18]的方法合成中间体(1)。

(2) 2,3,3-三甲基-1-[3-(三甲基-氨基)-丙基]-3H-吲哚(2)的合成

参照文献[19]的方法合成化合物(2)。将2,3,3-三甲基-3H-吲哚(5.00g, 0.031 mol)和3-溴丙基三甲基溴化铵(12.29 g, 0.047 mol)置于含30 mL无水乙腈的100 mL圆底烧瓶,回流12 h后减压除去溶剂,残留液中加入20 mL去离子水,用乙酸乙酯(3×20 mL)萃取,取水层于冷冻干燥机中冻干后直接使用。

(3) 吲哚花箐染料中间体(3)的合成

将化合物(1)(2.50 g, 14.00 mmol)、化合物(2)(500.00 mg, 1.47 mmol)及无水乙酸钠(500.00 mg, 6.10 mmol)置于含30 mL乙酸酐的100 mL圆底烧瓶,通氮气保护,于90 ℃条件下反应2 h后,减压除去溶剂,残留物过氧化铝柱,并用洗脱剂CH2Cl2和CH3OH(100 ∶1～100 ∶20,V∶V)进行洗脱得绿色固体,收率64%;1H NMR(400 MHz, DMSO)δ: 8.30(d,J=13.6 Hz, 2H), 7.67(m, 4H), 7.46(dd,J=13.9 Hz, 6.5 Hz, 2H), 7.32(m, 2H), 6.43(t,J=15.3 Hz, 15.3 Hz, 3H), 4.34(s, 4H), 3.78(s, 4H), 3.14(m, 18H), 2.80(s, 4H), 2.16(s, 4H), 1.84(s, 2H), 1.70(s, 12H);13C NMR(101 MHz, DMSO)δ: 172.66, 143.86, 142.28, 141.47, 129.09, 127.38, 125.69, 123.02, 112.11, 102.42, 62.60, 52.77, 49.49, 41.44, 27.99, 26.58, 21.33, 20.93; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C42H60ClN4{[M]+}218.4830, Found 218.4850。

(4) 吲哚花箐染料(4～6)的合成

在50 mL圆底烧瓶中,依次加入3(240.00 mg, 0.27 mmol)、碳酸铯(175.94 mg, 0.54 mmol)、四(三苯基膦)钯(46.80 mg, 0.041 mmol)及2倍当量的三苯胺硼酸溶解于10 mL 20%的乙醇,氮气保护下,80 ℃反应5 h后,减压除去溶剂,过氧化铝柱层析柱,并用洗脱剂CH2Cl2和CH3OH(100 ∶1～100 ∶20,V∶V)进行洗脱,得到绿色固体4,收率27%;1H NMR(400 MHz, CD3OD)δ: 8.24(d,J=14.0 Hz, 2H), 7.53(d,J=7.3 Hz, 4H), 7.49～7.33(m, 8H), 7.27(s, 4H), 7.15(dd,J=24.8 Hz, 14.2 Hz, 4H), 6.88(d,J=8.1 Hz, 1H), 6.77～6.67(m, 1H), 6.26(d,J=14.0 Hz, 2H), 4.27(s, 4H), 3.48(d,J=6.3 Hz, 4H), 3.21(s, 18H), 2.73(s, 4H), 2.32(s, 4H), 2.03～1.97(m, 2H), 1.76(s, 12H);13C NMR(100 MHz, CD3OD)δ: 170.9(s), 146.7(s), 141.1(s), 140.8(s), 139.9(s), 139.6(s), 131.6(s), 128.4(d,J=8.9 Hz), 127.7(s), 123.8(s), 123.1(d,J=12.4 Hz), 122.4(s), 121.3(s), 116.5(s), 109.5(s), 98.4(s), 62.2(s), 57.0(s), 51.5(s), 48.0(s), 26.4(s), 24.8(s), 20.2(s), 19.9(s); HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C60H74ClN5{[M]+}288.1976, Found 288.1993。

用类似方法合成5,收率23%;1H NMR(400 MHz, CD3OD)δ: 8.22(d,J=14.1 Hz, 2H), 7.96(s, 1H), 7.51(d,J=7.4 Hz, 2H), 7.45～7.41(m, 4H), 7.28～7.21(m, 6H), 7.08(t,J=6.3 Hz, 3H), 7.04(dd,J=7.5 Hz, 4.0 Hz, 2H), 6.24(d,J=14.1 Hz, 2H), 4.13～4.08(m, 4H), 3.65(t,J=5.8 Hz, 4H), 3.15(s, 18H), 2.71(t,J=5.9 Hz, 4H), 2.29(d,J=7.0 Hz, 4H), 1.90(dd,J=11.9 Hz, 6.0 Hz, 2H), 1.74(s, 12H);13C NMR(100 MHz, CD3OD)δ: 170.9(s), 141.1(s), 140.8(s), 139.8(d,J=8.7 Hz), 128.3(s), 127.7(s), 127.4(s), 126.7(s), 123.8(s), 123.6(s), 123.0(s), 121.3(s), 121.0(s), 116.5(s), 112.7(s), 109.5(s), 109.3(s), 98.4(s), 63.5(s), 57.0(s), 51.4(s), 48.0(s), 26.4(s), 24.8(s), 14.2(s); HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C56H69ClN4{[M]+}265.8502, Found 265.8517。

用类似方法合成6,收率15%;1H NMR(400 MHz, CD3OD)δ: 8.22(d,J=7.8 Hz, 2H), 7.52(d,J=7.0 Hz, 1H), 7.44(s, 2H), 7.37(d,J=3.8 Hz, 4H), 7.34(s, 2H), 7.32(s, 1H), 7.30(s, 1H), 7.23(d,J=8.0 Hz, 2H), 7.21～7.14(m, 2H), 6.29(d,J=14.0 Hz, 2H), 4.22(t,J=7.2 Hz, 4H), 3.32～3.28(m, 4H), 3.24(s, 2H), 3.19(s, 18H), 2.81(t,J=5.5 Hz, 4H), 2.27(s, 4H), 2.09～2.01(m, 2H), 1.19(s, 12H);13C NMR(100 MHz, CD3OD)δ: 172.0(s), 162.9(s), 148.7(s), 141.8(s), 140.9(s), 140.6(s), 134.4(dd,J=10.7 Hz, 3.3 Hz), 132.0(s), 129.4(d,J=4.9 Hz), 128.7(s), 128.4(s), 127.7(s), 124.7(s), 122.0(s), 110.2(s), 99.8(s), 63.0(s), 52.3(s), 48.6(s), 40.2(s), 29.3(d,J=8.2 Hz), 26.6(s), 24.4(s), 20.7(s); HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C54H70ClN5O2{[M]+}273.5171, Found 273.5187。

1.3 光学性质研究实验

精密称量吲哚花箐分子(4～6),用PBS(pH=7.40, 10 mM)缓冲液配制成1 mM的储备液,用时再以PBS缓冲液稀释至5 μM的待测液,测定其吸收光谱和荧光发射光谱(电压为中等,狭缝宽度均为5 nm)。单线态氧收率(ΦΔ)的测定以ICG为标准(0.80%)。

2 结果与讨论

2.1 目标吲哚花箐分子的设计合成

相较于ICG的多甲川链,IR780通过引入环烃基,增加了分子刚性和空间位阻,使单线态氧不易进攻,光稳定性得以改善[14-16]。本课题组前期将IR780的环烃基氯用柔性链取代,吸电子基团的引入提高了IR780的光稳定性,并能长时间在活体肿瘤组织近红外荧光成像[20]。为获得在含盐缓冲液中溶解性好的水溶性吲哚花箐染料,本文一方面沿用了课题组的成功做法,用吸电子的共轭芳环取代环烃基氯来增加分子的刚性和空间位阻。另一方面在吲哚N上引入季胺盐以增强分子的水溶性,设计合成了3个结构新颖的水溶性吲哚花箐染料,并用1H NMR、13C NMR和HR-MS对3个目标分子的结构进行了表征,确证为预期目标分子结构。

2.2 光谱性质

(1) 光谱性能

中间体3及3个吲哚花箐染料分子的吸收光谱和荧光光谱如图3所示。由图3(a)可以看出,合成得到的3个吲哚花箐染料分子的最大吸收峰均在752 nm,较中间体3蓝移26 nm,这可能是由于芳环的引入,使分子刚性增强、空间位阻变大,整个分子大π键的电子云流动性减弱,增加了分子激化所需要的能量,吸收光量子发生了蓝移,产生浅色效应[14]。同时,3个吲哚花箐染料分子摩尔吸光吸收分别为:16.64×104L·mol-1·cm-1(4)、 8.70×104L·mol-1·cm-1(5)和14.14×104L·mol-1·cm-1(6),表明3个目标染料分子在最大波长均具有强的光吸收性能。从结构来看,4和6的摩尔吸光系数显著强于5,这是由于4和6中基团的吸电子效应强于5[21]。

λ/nm

由图3(b)可以看出,中间体3的荧光发射峰位于800 nm,经修饰后分别蓝移至781 nm(4)、 775 nm(5)和778 nm(6),均分别蓝移了12 nm。从结构来看,4和6是由于1个芳环与环烃基偶联,其荧光量子效率差别不大,5因由刚性和位阻较大的蒽环直接相连,吸电子的蒽环与母核共轭结构不在1个平面,使整个分子的刚性减弱,不利于核外电子以光的形式释放能量,使其荧光发射强度显著降低[22]。4和6在近红外区均具有较强的荧光发射强度,可作为新型光敏剂的荧光成像应用于肿瘤的诊断或介导手术切除肿瘤[23]。

(2) 单线态氧收率的测定

本实验以1,3-二苯基异苯并呋喃(DPBF)作为单线态氧捕获剂,用ICG为标准,分别测定中间体3、 IR780及3个吲哚花箐染料分子在760 nm激光灯照射下和罗丹明B(RB)在532 nm激光灯照射下分解DPBF性能,结果如图4所示。由图4可知,中间体3、 IR780和3个吲哚花箐染料分子的单线态氧收率分别为0.42%(3)、 0.45%(IR780)、 0.67%(4)、 0.37%(5)和0.52%(6),表明在环烃基中位引入芳环可提高其单线态氧收率,并且引入给电子能力较强的三苯胺基团可以提高该类化合物的单线态氧收率。高的单线态氧收率是光敏剂作为光动力治疗的主要指标,4和6具有的高单线态氧产生率,可作为光动力治疗的新型潜在光敏剂[15]。

Time/s

本文通过引入刚性结构、增强空间位阻及柔性季胺盐增强水溶性,设计合成了3个新型水溶性吲哚花箐染料分子(4～6),并对其进行了结构表征和光谱性能研究。结果表明:3个吲哚花箐染料分子均具有良好的水溶性和处于近红外区的吸收和发射性能,4和6因其高的单线态氧收率和强的荧光强度,可作为新型光敏剂应用于肿瘤光动力治疗和荧光成像诊断研究,为开发具有实际应用价值的吲哚花箐染料提供了一定的参考价值。