年轻卵巢储备功能减退患者囊胚非整倍体率及妊娠结局的分析

宋雪梅，邓星，袁振亚，严为巧，黄晓洁，袁牧*

(1.徐州市妇幼保健院生殖医学中心,徐州 221009;2.宜春市妇幼保健院生殖医学中心,宜春 336000)

卵母细胞质量是辅助生殖技术(ART)助孕治疗中能否成功妊娠的关键因素之一。目前在实施ART前一般会对患者的卵巢储备功能进行评估,包括患者年龄、基础窦卵泡数(AFC)、基础卵泡刺激素(bFSH)和抗苗勒管激素(AMH)等[1-2]。随着女性年龄增加,卵巢储备功能逐步下降。近年来关于卵巢储备功能减退(DOR)的研究主要集中在不同促排卵方案在DOR患者中的应用效果[3-4],以及雄激素、辅酶Q10、生长激素等预处理方法对于DOR患者的辅助治疗[5]。之前有文献报道,ART治疗中35岁以下妇女每周期的活产率为32.2%,35至37岁妇女为26.2%,38至40岁妇女则进一步下降,仅为18.5%[6],故本研究中将年轻女性特指为<38岁的女性。Morin等[7]研究报道年龄<38岁DOR女性活产率低于卵巢储备功能正常患者的原因是其每个周期获得的卵母细胞数量少而非其卵母细胞的发育潜能差。但对于年轻(<38岁)DOR女性,其卵巢储备功能的过早减退是否会引起卵母细胞质量下降及增加胚胎染色体非整倍体率风险的研究报道仍较少。胚胎植入前非整倍体遗传学检测(PGT-A)是在胚胎植入宫腔前进行染色体数目的检测,以筛查非整倍体胚胎,挑选染色体正常的胚胎植入子宫,从而降低早期流产的风险[8]。本研究通过对因反复自然流产、反复种植失败和严重畸精子症行PGT-A的年轻DOR患者进行研究,探讨年轻女性DOR是否会影响胚胎的染色体非整倍体率,并进一步观察整倍体囊胚移植后胚胎的继续发育潜能。

一、资料与方法

1.研究对象:回顾性分析2020年1月至2022年9月在徐州市妇幼保健院生殖医学中心行PGT-A患者的临床资料,共计180例患者(243个周期),共收集达活检标准的囊胚737枚。将纳入患者按照是否存在DOR分为对照组(155例,196个周期)和DOR组(25例,47个周期)。纳入标准:(1)临床诊断为DOR[9](bFSH≥10 U/L,AFC≤5～7个,AMH≤1.1 ng/ml);(2)女方年龄<38岁;(3)反复种植失败(移植次数≥3次或累计移植≥4～6个优质胚胎或≥3个高评分囊胚仍未种植);(4)反复自然流产(≥2次自然流产);(5)严重畸精子症。其中DOR组纳入标准满足(1)(2)的同时需满足(3)或(4)或(5),对照组纳入标准满足(2)的同时需满足(3)或(4)或(5)。排除标准:(1)卵巢手术史;(2)单基因病;(3)夫妇一方染色体数目或结构异常;(4)手术取精者;(5)存在其它影响妊娠及流产因素者。所有行PGT-A的患者均签署知情同意书。本研究将非整倍体及嵌合体胚胎的移植排除在研究范围之外。

2.研究方法:(1)体外受精及囊胚培养:常规促排卵后B超引导下穿刺取卵,在培养箱中培养4 h后拆除卵母细胞周围的颗粒细胞,MⅡ期卵母细胞行ICSI授精,使用G-TLTM一步式培养液(Vitrolife,瑞典)进行胚胎培养,在时差成像培养箱(Embryo Scope+,Vitrolife,瑞典)内培养至囊胚。(2)囊胚活检和PGT-A:采用Gardner评分标准[10]对囊胚进行分级,评分≥3BC或3CB的囊胚用活检针取3～5个囊胚滋养外胚层细胞后按照玻璃化冷冻试剂盒(加藤,日本)操作说明进行玻璃化冷冻。活检细胞全基因组扩增采用胚胎植入前染色体非整倍体检测试剂盒,二代测序采用Illumina测序平台(北京嘉宝仁和),其中整条染色体异常、4 Mb及以上的拷贝数变异和染色体异常比例大于80%的囊胚为非整倍体囊胚,异常比例20%～80%的囊胚为嵌合体囊胚。(3)解冻周期移植及妊娠结果判定:采用人工激素替代周期准备子宫内膜,所有患者均进行单囊胚移植,于移植日给予黄体支持,移植术后5周行B超检查,宫内见孕囊及原始心管搏动者判定为临床妊娠,孕28周后的活胎分娩视为活产。(4)观察指标:患者的基本资料(年龄、不孕年限、AFC、bFSH、AMH、bE2等)、胚胎实验室指标(2PN率、囊胚形成率、活检囊胚整倍体率等)及妊娠结局(临床妊娠率、流产率、活产率等)。2PN率=正常受精胚胎数/获卵数×100%,囊胚形成率=总囊胚数/正常受精胚胎数×100%,可用囊胚形成率=活检囊胚数/正常受精胚胎数×100%,整倍体率=整倍体囊胚数/活检囊胚数×100%,非整倍体率=非整倍体囊胚数/活检囊胚数×100%,嵌合体率=嵌合体囊胚数/活检囊胚数×100%,临床妊娠率=临床妊娠周期数/移植周期数×100%,流产率=流产周期数/移植周期数×100%,活产率=活产分娩周期数/移植周期数×100%。

二、结果

1.患者基本资料比较:两组患者的年龄、不孕年限和bE2均无显著性差异(P>0.05);DOR组的AFC和AMH显著低于对照组(P<0.01),而bFSH水平显著高于对照组(P<0.05)(表1)。

表1 两组患者基本资料比较(-±s)

2.患者胚胎实验室指标比较:DOR组与对照组相比,2PN率、囊胚形成率、可用囊胚形成率和活检囊胚整倍体率、嵌合体率均无显著性差异(P>0.05)(表2)。

表2 两组患者胚胎实验室指标比较(%)

3.患者移植整倍体囊胚后的妊娠结局比较:对照组有125个周期进行了单囊胚移植,DOR组有20个周期进行了单囊胚移植。移植周期的患者年龄、不孕年限、子宫内膜厚度及优质囊胚移植周期比例(移植D5/D6优质囊胚周期占移植周期比例)均无显著性差异(P>0.05);临床妊娠率、流产率和活产率亦无显著性差异(P>0.05)(表3)。至撰稿时对照组随访发现宫外孕1例,胎儿畸形1例,活胎分娩51例;DOR组随访无宫外孕和胎儿畸形,活胎分娩7例,余在继续随访中。需要说明的是纳入本研究的25例年轻DOR患者形成的囊胚行胚胎植入前遗传学检测后有3例患者没有可移植胚胎,其中2例行2个周期促排卵分别获1枚和3枚可供活检的囊胚但均为非整倍体囊胚,另外1例行3个周期均未形成囊胚。

表3 两组患者整倍体囊胚移植周期的一般资料及妊娠结局比较[(-±s),%]

讨 论

生理状态下女性卵巢内原始卵泡随着年龄的增长而逐渐闭锁、退化[1]。本研究结果显示,虽然年轻(<38岁)DOR患者其AMH和AFC均显著低于对照组、bFSH显著高于对照组(P均<0.05),但两组间临床妊娠率和活产率并无显著性差异(P>0.05)。说明对于年轻DOR患者而言,AMH、bFSH和AFC等指标评估的是双侧卵巢内存储的原始卵泡数量,并不等同于卵母细胞质量。这与2020年Tiegs等[11]的研究报道一致,其发现年轻DOR女性(<35岁,AMH<1.0 ng/ml)行宫腔内人工授精(IUI)的妊娠结局与年轻卵巢储备功能正常的患者相似。还有研究发现在接受IVF治疗的女性中,DOR与活产率不存在相关性[12-13]。因此,不推荐无输卵管梗阻等不孕因素的育龄期年轻女性行常规卵巢功能评估,避免引起不必要的焦虑恐慌情绪。

PGT-A适应证包括高龄、反复自然流产、反复种植失败和严重畸精子症等[14-15]。此前有文献对不同PGT-A指征患者形成囊胚的非整倍体率和妊娠结局进行研究,认为年龄大于40岁女性患者形成的胚胎染色体非整倍体率显著增加,而反复种植失败患者的非整倍体率和活产率与反复自然流产患者相比无统计学差异[16-17]。2023年,本中心一项研究的结果显示年龄<38岁的反复种植失败、反复自然流产和严重畸精子症患者的胚胎整倍体率无统计学差异[18]。本研究依据卵巢储备功能情况对行PGT-A的患者进行分组,结果发现DOR组与对照组患者的2PN率、囊胚形成率和可用囊胚形成率均无显著性差异,但因AFC显著低于对照组,DOR患者单次促排卵获卵数少。因此,DOR组的患者往往需要多次取卵才能获得可利用的整倍体囊胚进行移植。本研究纳入DOR组的25例患者共47个周期,其中16例患者需进行≥2次促排卵周期来积攒胚胎。因此,建议DOR年轻患者尽早完成生育计划。但本研究纳入的DOR患者样本量偏少,年轻DOR患者对胚胎非整倍体率的影响仍需要后期多中心大样本研究的支持。

本研究结果显示年轻DOR患者与卵巢储备功能正常患者囊胚染色体整倍体率和活产率比较无显著性差异(P>0.05),提示年轻DOR患者卵巢内卵母细胞数目减少并不显著影响胚胎的继续发育潜能。若DOR患者一次促排卵无整倍体囊胚可移植,可以通过增加取卵次数来增加累计获卵数以获得更多可用于受精的成熟卵母细胞。有学者分别对年龄<38岁和≤40岁的DOR患者进行研究后发现,DOR组与卵巢储备功能正常的患者相比囊胚整倍体率和活产率均无统计学差异[7,19],本研究结果与其一致。2021年,Jaswa等[8]研究显示≤42岁DOR患者胚胎整倍体率显著低于卵巢储备功能正常的对照组,但按不同年龄分组(<35岁、35～37岁、38～40岁、40～42岁)统计的DOR患者胚胎整倍体率与对照组无统计学差异,可能的原因是DOR组平均年龄显著高于对照组所致(39.5岁 vs. 37岁),因为高龄患者本身卵母细胞质量下降影响了活检囊胚的整倍体率。因此,本研究中剔除了引起卵母细胞质量降低的生理性高龄因素来研究DOR人群。

综上所述,年轻DOR女性双侧卵巢内储备的原始卵泡数量减少与卵母细胞质量的好坏并无相关性,且并不影响囊胚的整倍体率和活产率,但因卵巢功能的衰退速度无法预估,建议有生育要求的年轻DOR女性尽早生育。