特医食品精优能缓解小鼠卵巢早衰发生的研究

冯艳芹，刘璇，刘晓婷，沈伟，李兰

(青岛农业大学生命科学学院/生殖科学研究院,青岛 266109)

POF的发生主要与机体内氧化应激水平相关[10]。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+)又称辅酶1,是氧化反应中必不可少的辅酶,具有有效的抗氧化作用[11]。大量研究报道,提高机体内NAD+的水平能够有效改善卵巢功能、提高卵泡及卵母细胞数量[12-13]。NDA+无法直接通过口服补充,但是补充NAD+前体,如烟酰胺单核苷酸(nicotinamide mononucleotide,NMN)、烟酸(niacin,NA)、烟酰胺核糖(nicotinamide riboside,NR)和烟酰胺(nicotinamide,NAM)能有效提高NAD+水平。有报道称,补充NA和NAM能够降低卵母细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平,有效改善卵母细胞质量[14-16]。此外,Wang等[17]发现,通过补充NA可以提高卵巢对氧化应激的反应能力,抑制细胞凋亡进而提高卵巢储备功能。除了NAD+前体外,Li等[18]发现卵母细胞体外培养过程中添加虾青素(一种天然抗氧化剂)能够提高抗氧化酶表达水平,维持卵泡及卵母细胞存活。由此可见,额外补充抗氧化剂能够有效改善机体内的氧化应激状态,提高卵巢功能。

单一药物的抗氧化能力有限,而精优能(包含了NAD+前体、虾青素、β胡萝卜素、核黄素等抗氧化剂)作为一种特殊的医学用途配方食品(特医食品),能较好地满足特定人群对营养素或者膳食的特殊需要。相较于普通食品,特医食品营养相对丰富,营养配比更合理、均衡,有利于提高患者的整体健康水平,为疾病的治疗提供良好的基础[19]。本研究对POF模型小鼠持续灌胃28 d精优能,通过观察其生殖系统的表型以及氧化应激等相关指标,探究精优能对POF发生的缓解作用。

材料与方法

一、实验动物

本实验所用实验动物为ICR小鼠(购买于济南实验动物中心)。小鼠集中饲养于青岛农业大学实验动物房,保证适宜的温度和湿度、充足的食物和饮用水。小鼠饲养及操作遵守实验动物管理条例,符合伦理规范。本研究经学院伦理委员会批准。

二、主要试剂

精优能(女士型),由同方药业集团提供,主要有效成分如表1所示。白消安(B2635;Sigma,美国);M2操作液(CE003;中国迈晨科技)、M16培养液(M7292;Sigma,美国);RNA快速提取试剂盒(AC0202;山东思科捷生物);兔抗小鼠Vasa同源体(mouse vasa homologue,MVH)多克隆抗体(ab13840;Abcam,美国)、兔抗小鼠骨形态生成蛋白15(BMP15)多克隆抗体(ab108413;Abcam,美国)、兔抗小鼠抗苗勒管激素(AMH)多克隆抗体(DF13527;Affinity,美国)、兔抗小鼠谷胱甘肽过氧化酶4(GPX4)多克隆抗体(A1933;武汉爱博泰克生物科技);DAB显色液(ZLI-9017;北京中杉金桥)和化学发光试剂盒(P0018;上海碧云天生物技术)。

表1 精优能女士型主要有效成分及其功能

表1 精优能女士型主要有效成分及其功能

成分化学分子式功能NAMC6H6N2O参与能量代谢、抗氧化NAC6H5NO2参与能量代谢、抗氧化虾青素C40H52O4抗氧化、抗炎症、抗癌β胡萝卜素C40H56抗氧化、抗癌症核黄素C17H20N4O6参与能量代谢、抗氧化

三、实验方法

1.小鼠处理方法:本实验使用3周龄ICR雌鼠,按照体重进行单次200 mg·kg-1·d-1的白消安腹腔注射,建立POF小鼠模型。然后将POF鼠分成5组:一组进行持续28 d的PBS灌胃,作为模型对照组(B组);其余4组小鼠每天按照体重分别灌胃50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg、400 mg/kg的精优能,持续28 d,标记为B+50、B+100、B+200、B+400组。另外,设立不注射白消安的空白对照组(CTRL组),PBS持续灌胃28 d。收集7周龄小鼠生殖器官样本,通过对生殖器官脏器指数(脏器重量与体重之比)进行统计,分析精优能缓解POF的最适浓度。然后,以最适浓度(200 mg·kg-1·d-1)再次进行POF挽救,通过观察生殖表型、氧化应激水平等指标,探究精优能对POF发生的影响。

2.小鼠卵巢石蜡切片与免疫组织化学染色:收集各组小鼠的卵巢,进行固定、冲水、梯度脱水、浸蜡、包埋、切片。得到白片后,进行二甲苯脱蜡、梯度复水、柠檬酸抗原修复;待抗原修复液自然冷却后,洗涤并进行封闭(30 min)、孵育一抗(生殖细胞标记蛋白MVH)(4℃过夜)、孵育二抗(37℃,45 min);二抗孵育结束,再次洗涤后,按每张片子100 μl滴加显色液,静置1 min后,在体视显微镜下观察染色情况;后经过PBS洗涤、苏木精染色、蓝化、复水、二甲苯透明、中性树脂封片,得到可用于进行卵泡统计的卵巢切片,待镜检观察。

3.GV期卵母细胞收集与体外培养:取7周龄小鼠卵巢,在M2操作液中剁碎卵巢,用口吸管将GV期卵母细胞捡出,移入M16培养液中,在37℃、5%CO2培养箱中进行培养,4 h后观察生发泡破裂(germinal vesicle breakdown,GVBD)的卵母细胞比例,12 h后统计第一极体排出(first polar body extrusion,PBE)的卵母细胞比例。

4.实时定量荧光PCR(RT-qPCR):按试剂盒步骤对新鲜卵巢组织进行RNA提取,并将各组RNA浓度调至一致,再按试剂盒要求将RNA反转为cDNA。配制RT-qPCR体系(20 μl),包含SYBR qPCR Master Mix、无酶无菌水、目的基因引物、cDNA,反应条件为5℃ 10 min、95℃ 15 s、60℃ 1 min,进行40个循环,检测卵泡发育相关基因Bmp15、Gdf9、Amh和抗氧化酶相关基因Sod2、Cat、Gpx4的表达水平。以Gapdh为管家基因,用2-ΔΔCt法计算mRNA水平。目的基因的PCR引物序列如表2所示。

为解决地级以上市行政区域交界河段执法问题，广东省组织主要江河沿线的地级以上市水务局签订了交界河段联合执法协议，在属地管理原则的前提下，进一步明确了工作职责和工作配合，努力消除执法的盲点。广东与广西交界的西江界首河段也签订了河道采运砂监管联合执法协议，并进行了多次协作执法。

表2 各基因的PCR引物序列(5’-3’)

5.蛋白免疫印迹技术(Westerm Blot,WB):新鲜卵巢组织加入蛋白裂解液,进行充分裂解后,离心收集上清液,并加入上清液1/4量的5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液,沸水煮5 min,制备蛋白上样液;在恒压100 V下进行12%聚丙烯酰胺凝胶电泳;随后,在恒流300 mA下,将目标蛋白转到聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF)上,进行PVDF膜的封闭、洗涤以及目标抗体(BMP15、AMH和GPX4)孵育;最后,使用化学发光液显色,检测BMP15、AMH以及GPX4的蛋白水平。以GAPDH作为内参蛋白,统计目标蛋白表达量。

四、统计学处理及方法

结 果

一、不同浓度精优能对POF小鼠体重及脏器指数的影响

为探究不同浓度精优能对POF发生的挽救作用,本研究对持续灌胃28 d的各组小鼠进行体重检测。结果发现,白消安处理的POF模型鼠以及灌胃精优能的POF鼠,体重无显著差异(P>0.05)(表3)。此外,我们还观察了7周龄小鼠生殖器官的形态,结果显示,各组小鼠卵巢和子宫形态没有明显差异(图1)。

A:7周龄小鼠卵巢形态图;B:7周龄小鼠子宫形态图。图1 各组小鼠卵巢及子宫形态图

表3 各组小鼠体重及生殖器官脏器指数比较(-±s)

通过统计脏器指数发现,白消安注射会造成小鼠卵巢和子宫指数显著降低(P<0.05),但在灌胃28 d的200 mg·kg-1·d-1(B+200组)或400 mg·kg-1·d-1(B+400组)精优能后,小鼠的脏器指数较B组显著提高(P<0.05)(表3)。

二、精优能对POF小鼠卵巢储备功能的影响

上述结果发现,灌胃一定浓度(200 mg·kg-1·d-1或400 mg·kg-1·d-1)的精优能,能够显著提高POF模型小鼠卵巢和子宫指数(P<0.05)。为了明确精优能对POF发生的影响,接下来主要探究200 mg/kg精优能对POF小鼠卵巢储备的挽救效果,并额外设置了非POF模型单独灌胃28 d精优能(200 mg·kg-1·d-1)的组别:CTRL+200(C+200)组。

分析卵巢切片及卵泡计数发现:B组、CTRL组、B+200组间比较,各级卵泡比例均无显著差异(P>0.05);各组总卵泡数分别为CTRL组(380.0±61.62)枚、B组(102.3±15.35)枚、B+200组(163±27.93)枚、C+200组(372.3±83.35)枚。B组总卵泡数较CTRL组显著减少(P<0.01);B+200组卵泡总数较B组显著增加(P<0.05)(图2A、2B、2C)。

A:孵育MVH抗体后的小鼠卵巢切面及各级卵泡形态(棕色示MVH阳性细胞,即卵母细胞),右侧列示各级卵泡典型图像(PmF:原始卵泡;PF:初级卵泡;SF:次级卵泡;AF:有腔卵泡);B:各组卵泡总数统计图;C:4组间各级卵泡比例统计图。与B组比较,*P<0.05,#P<0.01。图2 精优能改善POF小鼠卵巢储备

此外,RT-qPCR结果显示,与B组相比,B+200组卵泡生长相关基因(Gdf9、Bmp15)及卵巢储备相关基因(Amh)表达量显著升高(P<0.01)。同时,WB检测结果显示,灌胃精优能后卵巢组织中BMP15和AMH的蛋白水平也显著提高(P<0.05)(图3)。提示精优能补充能够改善POF小鼠的卵巢储备功能。

A:各组相关基因mRNA表达水平比较:与B组比较,#P<0.01;B:各组中BMP15和AMH蛋白表达水平比较:与B组比较,*P<0.05,#P<0.01。图3 精优能改善POF小鼠卵泡发育及卵巢储备相关基因的表达水平

三、精优能对卵母细胞数量及发育潜能的影响

在结果二中,我们发现精优能能够增加卵泡数量、改善卵巢储备,但其对POF小鼠卵母细胞发育潜能是否有影响还有待继续研究。因此,本实验收集了7周龄小鼠GV期卵母细胞进行体外培养,观察其发育情况(图4);并对GV期卵母细胞数量、GVBD率以及PBE率进行统计分析,结果发现,200 mg·kg-1·d-1的精优能能够显著增加POF小鼠GV期卵母细胞数量(P<0.05),促进了POF小鼠第一极体排出(P<0.05)(表4)。

图4 7周龄小鼠卵母细胞发育情况(比例尺:100 μm)

表4 不同处理各组小鼠卵母细胞成熟指标的比较(-±s)

四、精优能对POF小鼠抗氧化能力的影响

为了探究精优能是否是通过抗氧化作用缓解白消安造成的POF,我们检测了几种常见的抗氧化酶的表达水平。结果发现,与B组相比,B+200组卵巢组织内Sod2、Cat和Gpx4 mRNA水平均显著升高(P<0.05),GPX4蛋白水平也显著增加(P<0.05)(图5),提示精优能可以有效提高卵巢内抗氧化能力。

与B组比较,*P<0.05,#P<0.01。图5 各组小鼠卵巢组织内抗氧化酶表达水平比较

讨 论

大量研究证实,体内外各种不利因素会造成卵巢内卵泡数量降低、卵母细胞质量下降,最终导致卵巢功能衰竭,如POF[4,9,20]。其中,化疗造成的POF格外普遍。现阶段,有大量化疗药物用于构建POF小鼠模型,如顺铂、环磷酰胺、白消安等[8-9]。白消安是极少数能够在3岁以下儿童中使用的化疗药物之一,但对生殖能力有着严重损伤[21-22]。已有研究报道,白消安能够影响卵巢储备及卵母细胞质量[1]。本研究也发现,与空白对照组相比,注射白消安后,小鼠卵巢及子宫指数明显降低、卵泡及卵子数量也显著减少,呈现典型的POF症状。

临床上常常使用激素补充治疗来改善POF,但激素治疗存在依赖性,并且长期激素补充有可能造成腺癌、冠心病、中风等疾病[4,23]。近年来的研究发现,通过移植骨髓、脐带血等间充质干细胞也可以有效改善POF[24-26],但其临床试验还未成熟。因此,寻求有效缓解POF的方法格外重要。

从POF发生机制上而言,ROS水平升高是诱发POF的潜在原因之一[10,27]。本研究发现,持续灌胃28 d精优能后,能够降低白消安引起的POF小鼠的氧化应激水平,增加Cat、Gpx4等抗氧化酶的表达水平,有效缓解白消安诱发的POF小鼠卵巢及子宫指数、卵泡数量及卵母细胞成熟率的下降。这与先前的一些关于NAD+改善POF的研究结论[15,17,28]相一致。本研究发现,补充抗氧化剂尤其是复合型的抗氧化剂,可以有效改善化疗等因素引起的POF,也为临床POF患者提供了有效的食用级候选治疗产品。事实上,NA、NAM不仅能够改善POF,在生物医学其他方面也有潜在的应用前景,包括抗肿瘤、抗炎症、抗衰老等[29-30]。然而,需要注意的是,有研究称,补充过量NAM会造成生物毒性,影响卵母细胞减数分裂进程。因此,关于NAD+前体在人类中的应用,还有待加强机制探索和有效监督。

综上,本研究表明,持续28 d灌胃200 mg·kg-1·d-1的精优能,能够通过降低POF小鼠卵巢内氧化应激水平,缓解POF小鼠生殖器官指数下降、卵泡及卵子数量降低,并有效维持卵母细胞发育潜能,有效缓解POF的发展过程。