不同时期胚胎评分与单囊胚移植周期胚胎丢失的关系

段超群，邓星，彭伟，刘珍，张露，李清，解兴兴，韩艳

(宜春市妇幼保健院辅助生殖科,宜春 336000)

体外受精/卵胞浆内单精子注射(IVF/ICSI)技术迅速发展,临床妊娠率不断提高,可达50%,但抱婴回家率仍只有30%左右[1]。胚胎移植后可能出现胚胎丢失包括生化妊娠、流产等不良结局,因此如何选择最有发育潜能的胚胎移植是改善临床妊娠率、降低流产率的关键环节。囊胚阶段的胚胎具有与子宫内膜更为同步,并且能更好地判断胚胎发育潜能等优势[2-3]。囊胚移植虽然提高了临床妊娠率,但是胚胎丢失的情况并未见明显下降[4],这可能与我们在移植时选择的胚胎质量有关。形态学评分系统依然是目前应用最广泛的胚胎选择方法[5],然而胚胎发育是一个动态过程,单一时间点的观察并不能准确反映胚胎的发育潜能[6]。本研究通过回顾性分析IVF/ICSI助孕患者行单囊胚移植后,妊娠丢失发生与移植囊胚及其对应卵裂期胚胎评分、卵裂模式的关系,希望能指导临床挑选更适合的胚胎进行移植,从而改善临床结局。

一、资料与方法

1.研究对象及分组:回顾性分析2017年7月至2022年7月于宜春市妇幼保健院辅助生殖科行单囊胚移植且移植后β-HCG阳性的患者的临床资料。纳入/排除标准:女方年龄<40岁;受精方式为IVF或ICSI;单囊胚移植且移植后HCG阳性的周期;甲状腺、肾上腺功能等未见明显异常;排除子宫畸形(如纵膈子宫、双角子宫等)以及严重的输卵管积水、宫腔粘连、复发性流产、反复植入失败患者。本研究通过宜春市妇幼保健院伦理委员会批准。

共收集单囊胚移植后HCG阳性周期196个。根据临床妊娠结局将研究对象分为3组:生化妊娠组(34个周期)、早期流产组(22个周期)和持续妊娠组(140个周期)。

2.单囊胚移植周期资料回顾:促排卵方案采用早卵泡期长效长方案或拮抗剂方案,并在扳机后36～38 h行阴道超声监测下取卵术,取卵术后给予常规黄体支持。受精后第3天(D3)卵裂期胚胎转移至G2-plus培养液(Vitrolife,瑞典)中,在37℃、6%CO2及5%O2的三气培养箱中培养,培养至D5或D6囊胚期,行鲜胚移植或冻融胚胎移植(FET)。FET周期采用自然周期或激素替代周期准备内膜:月经规律有排卵患者行自然周期准备内膜,于排卵日后第5天进行单囊胚复苏移植;无排卵或月经周期不规律患者行激素替代周期准备内膜,根据B超检查提示的子宫内膜情况来拟定单囊胚复苏移植时间。

妊娠结局的判断:囊胚移植后第9天测定β-HCG水平≥20 U/L但移植后第28天行阴道B超监测未见孕囊者为生化妊娠;移植后第28天行阴道B超监测存在孕囊者为临床妊娠;临床妊娠但于12周前流产者为早期流产;临床妊娠且胎儿心管搏动维持至12周后者为持续妊娠。

3.连续性观察胚胎质量方法:对受精后D2和D3卵裂期胚胎、D5和D6囊胚期胚胎进行连续性观察并记录评分。D2和D3卵裂期胚胎评分参考Istanbul共识[7],根据卵裂球数量、碎片程度、卵裂球均匀度等进行评分,评分分为Ⅰ～Ⅳ级,其中Ⅰ和Ⅱ级为优质卵裂期胚胎。囊胚期胚胎评分参照Gardner囊胚评分法[8]进行,根据囊胚的扩张和孵出程度分成1～6期,3～6期囊胚进一步对内细胞团(ICM)和滋养层细胞(TE)分级为A～C,3BB及以上为优质囊胚。基于这一标准,将ICM评级或TE评级为A、B的归为优质ICM或TE(A+B)。胚胎评分均由两位实验室人员进行,一人评分,另一人核对,以减少主观差异。

4.观察/分析指标:患者的基础资料以及促排卵、受精/胚胎培养和囊胚移植相关指标。包括年龄、体质量指数(BMI)、不孕年限、不孕类型、基础卵泡刺激素(bFSH)水平、基础黄体生成素(bLH)水平、抗苗勒管激素(AMH)水平、窦卵泡计数(AFC);获卵数、成熟卵数;授精方式、D3优质卵裂胚比例、D2优质卵裂胚比例、D2～D3胚的4细胞(4C)到8细胞(8C)卵裂模式占比、优质ICM囊胚占比和优质TE囊胚占比;移植类型、内膜厚度、移植胚胎的优质囊胚比例。将D2卵裂至4C、D3卵裂至8C的D2～D3卵裂模式归为优质卵裂模式。

二、结果

1.患者基础资料比较:本研究共纳入196个单囊胚移植周期,其中生化妊娠组34个周期,早期流产组22个周期,持续妊娠组140个周期。3组间患者年龄、BMI、不孕年限、基础FSH、LH、AMH水平、AFC比较均无统计学差异(P>0.05);生化妊娠组原发不孕比例显著低于早期流产组和持续妊娠组(P<0.05)(表1)。

表1 各组患者基础临床资料比较[(-±s),n(%)]

2.患者促排卵、受精及单囊胚移植周期各参数比较:3组间获卵数、成熟卵数、IVF受精比例、新鲜周期比例、移植日内膜厚度比较均无统计学差异(P>0.05)(表2)。

表2 各组患者促排卵、受精及移植周期相关指标比较[(-±s),n(%)]

3.胚胎发育实验室指标比较:3组间囊胚评分、D2～D3卵裂模式、囊胚ICM评分、囊胚TE评分、囊胚形成时间比较均有统计学差异(P<0.05)。其中,生化妊娠组的优质囊胚率显著低于其他两组(P<0.05);生化妊娠组优质卵裂模式(D2～D3的4C～8C卵裂模式)占比显著低于早期流产组(P<0.05);生化妊娠组囊胚ICM和TE的A+B评分占比、D5囊胚占比均显著低于持续妊娠组(P<0.05);而3组间D2、D3卵裂期胚胎评分比较无统计学差异(P>0.05)(表3)。

表3 各组患者胚胎发育实验室指标比较[n(%)]

4.影响单囊胚移植生化妊娠的多因素Logistic回归分析:因年龄、BMI为常见影响生化妊娠的因素,故纳入年龄、BMI、不孕类型、ICM评分、TE评分等构建多因素Logistic回归方程。调整混杂因素后发现,继发不孕、囊胚TE评分、囊胚形成时间对单囊胚移植生化妊娠的影响具有统计学意义(P<0.05)(表4)。

表4 单囊胚移植生化妊娠的多因素Logistic回归分析

三、讨论

在IVF/ICSI治疗中,由于对患者妊娠结局的密切关注,生化妊娠的发生往往被捕捉到,其发生率为20%～30%;同时,辅助生殖技术助孕患者仍存在10%～20%的自然流产率,这无疑给不孕不育夫妇带来了巨大的心理创伤和经济压力[9]。如何降低生化妊娠率和流产率、提高活产率是辅助生殖领域一直备受关注的问题。而生化妊娠、流产与胚胎质量密切相关,随着单胚胎移植临床应用的增加,选择“最佳”胚胎进行移植并达到活产一直是临床的迫切需求。可能的方法之一是延长胚胎培养时间至囊胚阶段。尽管囊胚选择的形态学标准具有一定的主观性,但它排除了8细胞期后发育受损的胚胎,并降低了移植染色体异常的优质胚胎的风险[10]。

形态学评分仍是目前应用最广泛的胚胎评分方法。由于囊胚发育是一个阶段连续性的过程,从D2、D3卵裂期胚胎至D5、D6囊胚发育的各阶段我们都进行了形态学观察,主要观察指标为卵裂球细胞数目及其均匀度、胚胎碎片比例、囊胚扩张状态及TE、ICM情况等。郭映纯等[11]研究发现,移植优质卵裂胚来源的优质囊胚相较于移植非优质卵裂胚来源的优质囊胚,可获得较高的临床妊娠率和较低的流产率。Xia等[12]研究表明,相较于高质量卵裂胚来源的囊胚,低质量卵裂胚来源的囊胚移植组流产率较高。而Herbemont等[13]研究显示,D2和D3卵裂期胚胎质量的好坏并不影响囊胚的种植率和流产率。方璐等[14]研究发现,来源于D3优胚组和非优胚组的囊胚复苏移植后的流产率并无显著差异。以上研究显示不同卵裂期胚胎评分对囊胚移植妊娠结局的影响存在争议。那么囊胚评分及其对应的卵裂期评分对单囊胚移植患者的妊娠结局究竟有多大的参考价值呢?本研究通过比较单囊胚移植周期生化妊娠组、早期流产组和持续妊娠组的囊胚质量及其对应的D2、D3卵裂期胚胎质量参数,探究胚胎发育不同时期的评分对妊娠丢失的影响,为选择最具发育潜能的囊胚提供可能依据。

本研究共纳入196个单囊胚移植周期,其中生化妊娠组34个周期、早期流产组22个周期、持续妊娠组140个周期。3组间基础资料包括年龄、BMI、不孕年限、基础性激素水平、AMH水平、AFC、获卵数、成熟卵数、受精方式、移植周期类型及移植日内膜厚度等比较均无统计学差异;生化妊娠组的继发不孕比例(88.2%)较早期流产组(59.1%)和持续妊娠组(65.7%)更高。同时我们探讨了移植囊胚评分、对应的D2/D3卵裂期胚胎评分、D2～D3卵裂模式、囊胚ICM评分、囊胚TE评分、囊胚形成时间(D5/D6)与生化妊娠和早期流产的关系,结果发现,生化妊娠组的优质囊胚率(70.6%)较早期流产组(100.0%)和持续妊娠组(93.6%)显著降低;与持续妊娠组相比,生化妊娠组的囊胚ICM和TE的A+B评分占比、D5囊胚占比均显著降低。

为排除混杂因素影响,本研究进一步以生化妊娠组为病例组、持续妊娠组为对照组进行了多因素Logistic回归分析。因为年龄、BMI为常见影响生化妊娠的因素,将其也纳入回归方程。调整混杂因素后,结果发现继发不孕、TE评分、囊胚形成时间对单囊胚移植生化妊娠的影响具有统计学意义(P<0.05)。生化妊娠组移植TE评级为A/B的囊胚所占的比例较持续妊娠组显著降低(P<0.05),这意味着囊胚TE评分与持续妊娠相关。Honnma等[15]也发现TE的形态学评分与持续妊娠率呈显著正相关。可能是评分更高的TE细胞分泌HCG的时间更早且分泌量更多,而HCG能够刺激黄体生成,调节子宫内膜容受性,在维持妊娠中发挥重要作用[16]。此外,本研究中生化妊娠组移植D6囊胚比例显著高于持续妊娠组,这可能与D6囊胚中非整倍体率高于D5囊胚有关[17]。然而,多因素Logistic回归分析发现移植囊胚对应的卵裂期评分并非单囊胚移植妊娠丢失的独立影响因素(P>0.05),这与Herbemont等[14]的研究结果一致,即D2和D3卵裂胚质量的好坏并不显著影响囊胚移植的流产率。此外,Poulain等[18]发现,移植D3质量较差胚胎来源的优质囊胚后,植入率为29.4%,研究认为D2或D3胚胎形态学评估的预测价值有限。根据目前的研究结果,如果采取囊胚移植策略,可以建议胚胎学家在第2天不再评估胚胎质量,这样可以避免非必要地从培养箱中取出培养皿,从而减少胚胎培养环境变化对后续植入率等的潜在影响[19]。

综上所述,无论卵裂阶段的胚胎质量如何,我们建议优先选择D5优质囊胚进行移植,并优先考虑TE评分级别高的囊胚,以期减少IVF/ICSI治疗中胚胎丢失的发生。但因本研究样本量较小,后续还需进一步扩大样本量加以探讨,以验证囊胚评分及其对应的卵裂期评分对妊娠丢失的影响。