精子浓度在精子凋亡率及生精细胞脱落状态中的作用分析

袁长巍，沈肖方，袁晓立，谭双，曹兴午

(1.北京美中宜和北三环妇儿医院,北京 100088;2.中日友好医院,北京 100029)

精液分析是评价男性生育力最基本、最直接、最重要的检测项目,包括精液外观、精液量、pH值、液化状态、粘稠度、精子浓度、精子总数、精子活动率、精子活力分级、圆形细胞及精子形态等参数。但精液分析并不能准确预测因精子质量变化而产生的影响,因此有必要寻找其他的检测指标,来提高男性生育能力的预测和管理[1]。在精子形态学评估过程中,我们更多关注正常与异常形态精子的百分率。而对于精子凋亡情况及生精细胞脱落状态并未给予足够的重视。精子凋亡率可以反映异常染色质状态,而精液中生精细胞脱落增多则提示可能存在精子发生障碍或生精上皮受损。精液分析不仅可以对患者的生育能力提供一个初步评估,还可以对引起某些生育障碍的病因、病变发生部位提供参考,为确定病因或是否需进一步检查提供依据[2]。目前,关于正常精子浓度与低精子浓度的精子凋亡率及生精细胞脱落状态报道极少,本文对此进行分析并进一步探讨其在男性不育实验诊断中的应用价值。

一、资料与方法

1.研究对象:回顾性分析2022年8～12月于北京美中宜和北三环妇儿医院生殖男科就诊的861例不育症患者的临床资料。根据世界卫生组织(WHO)《人类精液检查与处理实验室手册(第5版)》的参考标准[3]将纳入患者按照不同精子浓度分为两组:精子浓度≥15×106个/ml的为正常精子浓度组(n=775),精子浓度<15×106个/ml的低精子浓度组(n=86)。

2.精液标本采集及检测:禁欲2～7 d后,采用手淫法取精。将精液放置于37℃水浴箱内,待完全液化后,充分混匀后进行检测。采用北京穗加软件提供的计算机辅助精子分析(CASA)系统,分析精子浓度及活动率。采用精子染色液(Diff-Quik)试剂盒(深圳华康生物),分析精子形态并严格按照操作流程及WHO手册所给出的评估标准[3]进行分类计数,每张涂片至少评估200个精子,并计数正常和异常及头部缺陷、中段缺陷、主段缺陷及过量残留胞质精子的百分率。每张涂片评估两次,以确保两次结果无较大差异,计数200个精子内头部暗染、固缩(凋亡)精子所占的比例分析精子凋亡率。并计数在200个精子范围内精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞及精子细胞的脱落数量及占比情况。

二、结果

1.一般资料:与正常精子浓度组比较,低精子浓度组精子活动率和正常形态精子率显著降低,精子凋亡率显著升高(P<0.05),两组间患者年龄比较无显著差异(P>0.05)(表1)。

表1 两组患者一般资料比较(-±s)

2.生精细胞比较:在正常精子浓度组中共检出995个生精细胞,平均每例检出1.28个生精细胞(200个精子范围内);而低精子浓度组中共检出440个生精细胞,平均每例检出5.12个生精细胞(200个精子范围内)。正常精子浓度组生精细胞检出率显著低于低精子浓度组(P<0.05),两组间各级生精细胞占比情况均无显著差异(P>0.05)(表2)。

表2 两组间生精细胞检出率及各级生精细胞占比情况比较(%)

三、讨论

精子的数量、活力及形态分析是评价精液质量最为经典的3个参数,各参数之间密切联系,即使精子浓度或(和)活力正常,形态缺陷也可能影响精子受精能力,且为最重要的单一因素。精子形态是精子的外貌特征,在一定程度上亦是反映精子优劣的基础。WHO《人类精液检查与处理实验室手册》(第6版)[4]强调,精子形态学的评估价值不仅可用于判断自然妊娠和辅助生殖技术(ART)结局的预后,还可以为睾丸和附睾功能判断提供更多有诊断价值的信息。因此,在遵循精子形态学标准化评估的同时,对其各部位的缺陷特征与潜在疾病的关系应给予更多关注。特别是对于某些特异性畸形精子、凋亡精子及生精细胞的检出,临床上应给予重视。

Diff-Quik染色法是WHO推荐的精子形态学染色方法之一,因其简单快速的特征在各实验室广泛应用。Diff-Quik染色法不仅可以观察精子和生精细胞的形态,还可以通过精子头部暗染程度来判断和计数精子的凋亡率,在每张精子涂片中都可以看到浅色(正常染色模式)和深色(暗染、固缩)染色的精子头部,后者则代表异常染色质状态,属于细胞凋亡的形态学特征,为精子DNA损伤的结果和表现[5]。精子头部颜色较暗,其发生机制可能与精子DNA链断裂或压缩异常有关,最终导致染料结合位点增多而出现暗染状态。精子凋亡在精子发生过程中是一个重要特征,自发性凋亡在维持精子的数量和质量方面非常重要,而诱发过多的精子凋亡则属于病理现象,是导致精子DNA损伤的机制之一。精液中可以看到各种形态的凋亡精子,尤其以小头精子最为常见;小头精子常伴有顶体发育异常,这也是导致受精失败的重要原因。虽然凋亡精子有一定的活力存在,但自身细胞结构已发生了变异,凋亡精子比例越高,发生不育的风险亦升高。末端脱氧核苷酸转移酶脱氧尿嘧啶缺口末端标记法(TUNEL)主要用于特异性检出精子凋亡引起的DNA损伤,灵敏度高,可用于精子DNA损伤的量化分析。有研究发现,Diff-Quik染色后,暗染精子(凋亡)百分率与TUNEL阳性精子比例呈现显著相关性[6-7]。当把精子暴露于可促进DNA断裂和染色质解聚的条件下,如过氧化氢、高温环境时,其暗染精子百分率也显著增加。有学者建议将32%的暗染率作为胚胎发育和妊娠的预测阈值,且该阈值与精子染色质结构分析法(SCSA)所建议的阈值(精子DNA碎片化指数≥30%)非常接近[7-8]。因此,当实验室缺乏成熟可靠的精子DNA检测方法时,Diff-Quik染色可作为评估精子异常染色质的一种参考指标,但此方法具有一定的主观性,染色时间过长可影响评估结果,规范化培训可减少结果的可变性。

在不同精子浓度精液中,精子凋亡均有一定的发生率。本研究结果发现,低精子浓度组不仅表现为精子活动率和正常形态精子百分率降低,而且精子凋亡率也显著高于正常精子浓度组(P<0.05)。低精子浓度患者常因睾丸生精功能低下引起,病因众多且复杂,有害因素可直接或间接的造成睾丸及附属腺体受损、内环境紊乱、生精功能障碍等,这可能是导致精子数量较少,精子凋亡率增高的重要原因。引发精子凋亡异常的机制较为复杂,而精子的“凋亡逃逸”可能会使具有DNA损伤的生精细胞逃避某些凋亡途径,并进一步分化为携带损伤DNA的成熟精子[9]。另外,生精细胞凋亡主要由生精细胞表面的肿瘤坏死因子受体超家族成员6(Fas)和支持细胞表面的Fas配体通过Fas/FasL途径介导,Fas/FasL途径可能是控制精子凋亡的重要途径[10]。卵胞浆内单精子注射技术(ICSI)的使用可以使卵母细胞在不依赖于精子形态学的情形下完成受精,这在一定程度上削弱了精子形态学分析的临床应用价值。由于精子缺陷的部位、受损程度及凋亡率不同,其生育结局可能有所不同。精子凋亡率升高必然会增加精子挑选困难,而凋亡精子的注入将可能诱导胚胎发生凋亡、囊胚形成率降低,继而引起胚胎发育异常、早期流产甚至异常缺陷等的发生概率增加[11]。特别是对于一些因精子数量少而无法进行精子DNA检测的精液标本,精子形态凋亡率分析可能对ICSI治疗预后判断有一定的参考价值。

正常精液中可见大量精子和少量生精细胞,各级生精细胞按数量、比例有序排出,呈常态脱落。由于睾丸受损的时间、程度及导致受损的因素不同,其生精细胞的脱落状态及临床表现也不尽相同[12]。本课题组研究发现,低精子浓度组精液中生精细胞的检出率显著高于正常精子浓度组(P<0.05),且平均每例精液生精细胞检出的数量(200个精子范围内)为正常精子浓度的4倍。在低精子浓度组中,生精细胞的检出主要以精子细胞最为常见,初级精母细胞次之,精原细胞和次级精母细胞较为少见,与正常精子浓度组比较,各级生精细胞的脱落比例均未见显著差异(P>0.05),说明生精细胞脱落增多是睾丸受损的敏感信号,是导致精子生成受阻、数量减少的重要原因,虽然各级生精细胞的比例并未表现出异常,但在部分低精子浓度精液中,仍可以观察到生精细胞阻滞(部分)在初级精母细胞或精子细胞阶段。在低精子浓度精液中,生精细胞常表现为凋亡特征,而凋亡的发生涉及一系列基因的激活、表达及调控等机制,其本质是更好的适应生存环境而主动采取的死亡过程。睾丸生精功能障碍的病程发展,必定有初始-受损-轻度-中度-重度的病变过程,生精细胞脱落也必然有早期、中期、高峰期和空化期的不同表现,以至精子数量的多寡及形态学的改变与睾丸损伤程度密切相关。如何及时、有效地控制生精细胞的持续性脱落仍是临床上关注的重点和难点;而生精细胞的动态变化,可作为疗效观察和判断预后的重要指标。

综上,Diff-Quik染色不仅可以观察精子的形态,还可以评估精子凋亡及生精细胞脱落状态。特别是对于低精子浓度患者,进行精液生精细胞和精子凋亡率检查,对进一步了解睾丸生精功能受损程度及精子异常染色质状态有着重要价值。精液细胞学分析已进入推广和应用阶段,可以在推广和实践中不断地深入、丰富、纠正和完善。而凋亡精子分类在临床上的应用前景仍值得继续关注、探讨和总结。