生物技术降解海带岩藻聚糖硫酸酯分子研究现状

聂小伟，何粉霞，毕可海，张玉清

（威海海洋职业学院，山东 威海 264300）

0 引言

对多糖进行改性修饰，可改变其结构构象和基团种类，从而改善其生物活性[3]。常用改性修饰方法包括物理或化学降解改变多糖分子量大小，或用化学修饰引入新的官能团，从而改变其基团种类[5]。目前，对海带多糖改性常采用改变其分子量，来提升多糖生物活性，将2 种改性方式联合改性的研究目前鲜见报道。

1 海带岩藻聚糖硫酸酯分子结构与生物活性的构效关系

海带岩藻聚糖硫酸酯是含多支链的2,4 - 硫酸酯基，由1,3-α-L- 岩藻糖聚合成的天然、复杂多糖，并且受生长地域和环境的影响[5]，主要糖成分包括半乳糖、α-L- 半乳聚糖和岩藻糖等[6]。其抗凝血活性与4-α-L- 岩藻糖-1 单元上C3 位置有关，其凝血活性与硫酸酯含量呈正相关，且岩藻聚糖的低分子量较中分子量降血栓活性效果更好。可见，岩藻多糖的硫酸酯的位置、含量及分子量会影响其抗凝血活性[7]。 有研究发现，经降解处理的硫酸化多糖片段，其硫酸酯含量越多，抗氧化能力越强；低分子量的片段对样品氧化作用、抑制作用越好，而大分子量的抑制效果较差。

同时证实，经自由基氧化降解得到的低分子量海带岩藻聚糖硫酸酯具有抗氧化和改善血脂黏度作用，如降低血脂沉积和溶血栓等作用[8]。

海带岩藻多糖的结构见图1。

图1 海带岩藻多糖的结构

1.1 海带岩藻聚糖硫酸酯分子量大小对其生物活性的影响

海带岩藻聚糖硫酸酯的相关生物活性与其分子量大小呈反相关，主要是由于小分子量多糖成分更容易渗透细胞膜结构，达到受体部位与配体发生反应，调节机体生理功能。

研究表明，具有抗凝血活性的岩藻聚糖硫酸酯分子量一般为21~24 kDa，在C-4 位置有硫酸基，并且多糖组分中硫酸基、岩藻单糖与半乳糖含量呈一定比例。海带和藻多糖硫酸酯的抗凝血活性随分子量的增大而增强，但分子量超出一定范围后其抗凝血活性会降低，在分子量为8 000 Da 的样品抗凝血活性最强。通过体外试验证实，低分子量海带多糖硫酸酯的抗氧化活性，其清除超氧阴离子和自由基的能力随分子量的减小而增强；低分子量组分对胆固醇酯氢过氧化物有很好的抑制作用，较大分子组分显著提高，而且硫酸根含量越高，抗氧化效果越好。同时，海带中的低分子量岩藻聚糖硫酸酯可以有效减轻糖尿病、肾病引起的炎症反应，其分子量更小的组分，阻止草酸钙形成的能力越强[8]。

海带岩藻聚糖硫酸酯分子量大小对其生物活性的影响见表1。

表1 海带岩藻聚糖硫酸酯分子量大小对其生物活性的影响

1.2 海带岩藻聚糖硫酸酯硫酸基团对其生物活性的影响

硫酸基是一种重要的生理活性阴离子基团，在海带多糖中的含量会影响其抗氧化活性和其他生理活性，并具有正相关性。研究表明，分子量大小和硫酸基含量对日本海带岩藻多糖的抗凝血活性有显著影响，随分子量和硫酸化糖残基的增加，其抗凝血活性越强，并且高硫酸化程度对纤维蛋白凝血酶发生反应具有显著影响。通过对比发现，具有相同结构的低分子量岩藻多糖，当硫酸基团含量达到20%以上时，其抗凝血活性显著增强。同时，经双硫酸基取代的泡叶藻褐藻多糖硫酸酯，其抗凝血活性也能显著增强[9]。

高热、眼结膜充血却不伴分泌物增多、口腔及粘膜充血、手足硬肿、躯干有多形红斑、颈部淋巴结肿大、白细胞和C反应蛋白阳性，出现这些症状是的川崎病表现，不是一般的细菌和病毒感染，治疗不及时会有心脏方面的后遗症，要警惕。

Saha S 等人[10]在研究海带多糖的抗病毒活性时，用浓硫酸改性制备硫酸基含量更高的海带多糖样品，经对照试验发现其抗病毒活性与硫酸基含量相关，更高的硫酸基含量的海带多糖样品具有更好的抗病毒活性。但也有报道指出，在某些情况下硫酸基含量对海带多糖的活性影响不大。Peng Z 等人[11]在研究分子量与海带多糖的抗氧化活性发现，分子量较大时，硫酸基及糖醛酸含量对海带多糖的抗氧化能力影响并不显著，其原因可能是硫酸基团阻碍了海带多糖与自由基的反应，而在分子量较小时硫酸基含量对海带多糖的抗氧化能力影响较大。

有研究发现，海带多糖清除超氧阴离子自由基能力与其硫酸基含量呈正相关。在岩藻多糖C-3 和C-4 位上与三氧化硫三甲胺进行硫化反应，得到一种过硫酸化岩藻多糖，由于硫酸基带较大负电而使岩藻多糖形成负电荷空间，与蛋白质结合抑制癌细胞的生长。并且硫酸化程度越高，抑制效果越显著。

海带岩藻聚糖硫酸酯硫酸基团对其生物活性的影响见表2。

表2 海带岩藻聚糖硫酸酯硫酸基团对其生物活性的影响

1.3 海带岩藻聚糖硫酸酯单糖组成对其生物活性的影响

褐藻多糖硫酸酯的抗氧化活性与褐藻糖、硫酸根的含量及单糖的种类有关。 Peng Z 等人[11]从海带中提取、分离出WPS1、WPS2 和WPS3 共3 种多糖组分，对其单糖组成种类和含量分析发现，3 种多糖中均含有鼠李糖、岩藻糖、半乳糖、甘露糖和木糖，并且WPS1 中木糖和WPS2 中鼠李糖含量最高，两者中甘露糖和岩藻糖含量也较高，但WPS1 具有最强的超氧阴离子自由基清除能力，WPS2 具有最强的羟基自由基清除能力。张加幸[9]研究发现，将提取的海带多糖经纯化、分级得到3 个多糖组分F1、F2 和F3，其中组分F3 的超氧阴离子自由基清除能力和羟基自由基清除能力均最强，F3 只由岩藻糖和半乳糖2 种单糖成分组成，且岩藻糖和半乳糖成分较其他3 种多糖中单糖组分均为最低，可见海带岩藻聚糖硫酸酯中半乳糖含量与其抗氧化活性相关。

1.4 不同品种和加工方式的海带岩藻聚糖硫酸酯对其生物活性的影响

张加幸[9]选取新奔牛、早熟、三海和海科1 号4 种品种新鲜海带提取的岩藻聚糖硫酸酯进行体外抗氧化活性分析发现，在一定浓度范围内，上述新鲜原料制备的岩藻多糖均表现出清除DPPH 自由基和羟自由基的能力，并且岩藻多糖浓度与自由基清除能力呈正相关。而在同等浓度条件下，早熟品种岩藻多糖的DPPH 自由基和羟自由基清除能力最低。经过晾晒、压榨和漂烫加工处理的海科1 号海带制备的岩藻多糖，在相同浓度下，新鲜海带组对自由基清除能力最强，压榨组次之，晾晒组最低。

1.5 海带岩藻聚糖硫酸酯化学修饰对其生物活性的影响

化学修饰可以提高褐藻多糖活性，降低毒副作用的有效化学改性手段。研究发现，海带岩藻聚糖的硫酸基取代度越大，海带多糖的抗凝血和抑制细胞增殖活性越强。通过对褐藻多糖硫酸酯的过硫酸化修饰，可抑制肿瘤新生血管内皮细胞生长因子作用，从而提高其抗肿瘤能力[12]。汪东风等人[13]用四价铈离子与褐藻多糖发生螯合反应，生成水溶性褐藻多糖铈配合物。在中性缓冲溶液体系下，能降解牛血清白蛋白，但对质粒无明显活性作用。傅德贤等人[14]用Fe3+和Zn2+与半叶马尾藻多糖进行反应，生成的海藻多糖铁锌配合物。在小鼠体内试验中发现，可以显著提高小鼠血液中血红蛋白和红细胞数量。

2 海带岩藻聚糖硫酸酯降解技术研究现状

海带多糖的化学结构组成决定了其具有的功能活性，对其结构的准确解析，显得尤为重要。通常解析多糖结构，需将其降解为低分子量片段，依据片断信息推测其结构组成。同时，已证实低分子量海带多糖更易被人体消化道吸收，且生物活性有显著改善[15]。由此可见，将海带多糖进行降解低分子化显得尤为重要。

目前，强酸、生物酶、超声波/微波辅助和自由基氧化降解技术在褐藻多糖降解研究中较常用，其各具优缺点。传统的酸碱降解技术工艺简单、投入低，但反应剧烈、不易控制、易发生副反应，如脱硫酸基等。自由基氧化降解技术条件温和、易于操作、副反应破坏少、无脱硫酸基作用、成本低廉、效率高，因此对该法降解海带硫酸化多糖的研究报道较多[16]。超声波降解方法效果较好，采用超声波降解海带多糖分子，可有效控制降解分子量的分布范围[17]。而海带多糖生物酶降解技术选择性好，反应温和，目标分子量片段集中，但从自然界中获取困难，目前没有商品化的生物酶，成本较高[18]。可见，采用生物降解技术获得不同分子量海带岩藻聚糖硫酸酯，具有很高的应用价值。

岩藻聚糖硫酸酯不同降解技术对比见表3。

表3 岩藻聚糖硫酸酯不同降解技术对比

3 生物降解海带岩藻聚糖硫酸酯初步研究

3.1 生物降解海带岩藻聚糖硫酸酯概述

能够降解海带岩藻聚糖硫酸酯的生物酶是岩藻聚糖裂解酶，包括岩藻聚糖酶，α-L- 岩藻糖苷酶和硫酸酯酶，主要来源于食用褐藻的软体动物内脏，如鲍鱼内脏等，以及部分海洋微生物，如Pseudomonas carrageenovora 和Pseudomonas atlantica 等细菌类，Aspergillus wentii（PZ322） 和Dendryphiella arenaria TM94 等真菌[19]。Sakai T 等人[20]分离出岩藻聚糖酶从海洋细菌Fucophilus fucoidanolyticus 中，该酶只能获得葡萄糖醛酸残基所连接的糖苷键，从裂解奥氏海藻岩藻聚糖分子中岩藻糖C2 位上支链。Tanaka K 等人[21]利用α-L- 岩藻糖苷酶裂解岩藻糖苷链获得L- 岩藻糖单硫酸盐，该酶由鲍鱼肝脏中提取纯化所得。

不同生物降解形式对海带岩藻聚糖硫酸酯的影响见表4。

表4 不同生物降解形式对海带岩藻聚糖硫酸酯的影响

3.2 生物酶降解海带岩藻聚糖硫酸酯的研究现状

有学者从海洋软体动物消化腺中提取有降解褐藻多糖活性的蛋白质，并发现黄杆菌可被岩藻多糖诱导产生将自身组分降解为小于10 000 Da 低分子物质的生物酶，降解过程中几乎不会脱硫酸酯基。另外，一些研究人员从刺参、墨角藻和绳藻中分离出的3 种假单胞菌，均可内切降解岩藻多糖组分为α-L 型低分子量硫酸酯多糖。同时，有学者将一株可产降解海藻多糖内切酶的海洋细菌，用于降解一种裙带菜的岩藻聚糖，获得7 种分子质量从305~3 749 Da 的岩藻多糖的片段[22]。

利用生物酶对多糖进行降解，可获得分子质量较均一、集中的降解产物，并且不破坏多糖结构。此法的主要优点是高效专一、反应温和、控制简单，将成为未来海洋多糖降解方法的研究热点。该法唯一不足是成本较高，还没有商品化的产品应用于实际生产。

3.3 微生物降解海带岩藻聚糖硫酸酯的研究现状

海带多糖降解菌株或生物酶的高效获取，将影响海带多糖深加工利用的前景。有学者从海洋微生物中筛选出一株产岩藻聚糖降解酶的杆菌，以及从酪酸梭菌、粪链球菌和弧菌等细菌中提取出一种糖基转移酶，可将羊栖菜、裙带菜和海带等褐藻中岩藻多糖组分降解成30 000~50 000Da 的岩藻聚糖硫酸酯[22]。

同时，国内学者从腐烂海带中筛选出一株芽孢杆菌和嗜盐白蚁菌，分别具有褐藻胶裂解酶活性、淀粉酶及褐藻胶裂解酶活性；还有学者从海带和海带生产海域的海泥中，筛选出一株与芽孢杆菌有同源性、能降解海带多糖的类芽孢杆菌菌株；以及通过筛选目标菌群，组建具有海带降解功能的人工菌群。但目前能有实际应用价值，产复合降解酶的复合菌群还未见报道，绝大部分还停留在实验室研究阶段[23-24]。

从中国人的粪便微生物中分离出能够降解琼胶和卡拉胶的菌株，证明人肠道微生物可以降解这些海洋硫酸多糖，并对肠道有益菌有促进作用[25]。谢洁玲等人[26]研究表明，人体肠道微生物只能对少量分子量大于20 kDa 的高分子量岩藻聚糖硫酸酯降解成为寡糖，而低分子量岩藻聚糖硫酸酯中的寡糖几乎全部被利用，证明肠道微生物对岩藻聚糖硫酸酯降解利用的难易程度与其分子量的大小有关。

4 生物降解海带岩藻聚糖硫酸酯的初步试验及应用展望

研究现状表明，由于物理降解岩藻多糖的效率低，分子量大，多用于辅助自由基氧化降解的研究，实际生产中不常见。而酸水解岩藻聚糖硫酸酯得到的低聚糖产率也较低，而且得到的多糖均一性差，脱硫现象比较严重，脱盐步骤繁琐；自由基降解法既能有效降解高分子量岩藻聚糖又能较好地保留硫酸基团，在工业生产中易于控制，是一种较理想的化学降解法。

生物酶降解高效专一、反应温和，降解产物分子量较均一、集中，并且不破坏多糖结构，酶解过程中无需加入其他反应试剂，也没有副产物的生成。而目前可用的降解商品化酶很少，价格贵，成本高，若能找到合适的酶或产酶微生物将会大大促进酶降解法的应用。可见，未来寻找合适于糖苷键水解酶，用于特异性制备寡糖成为研究的热点。