线粒体自噬在糖尿病心肌病中的作用研究进展

徐挺 池菊芳 郭航远

作者单位：310058 杭州，浙江大学医学院（徐挺）；绍兴市人民医院心内科（池菊芳）；绍兴文理学院医学院（郭航远）

糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy, DCM）是Rubler 等[1]于1972 年首先发现并提出的一种不能用冠心病、高血压或其他心脏疾病解释的特异性心肌疾病。线粒体自噬是细胞降解异常或多余的线粒体以纠正线粒体功能障碍，改善线粒体质量并维持心脏稳态的过程[2]。有效清除损伤的线粒体对于遏制活性氧簇（reactive oxygen species, ROS）引起的恶性循环至关重要。生理情况下，线粒体自噬通过清除损伤的线粒体来发挥保护作用。而在DCM 的病理情况下，线粒体自噬的调控变得复杂，在1 型和2 型糖尿病中线粒体自噬可能发挥不一样的作用，当线粒体自噬受到抑制时，异常线粒体清除不足导致ROS 积聚过度引发心肌细胞死亡；而线粒体自噬过度激活时又会因线粒体清除过多无法满足心肌的能量供给。本文对线粒体自噬的分子机制及其在DCM 中的研究进展作一综述。

1 线粒体质量控制与线粒体自噬

线粒体作为一种双膜细胞器，是氧化磷酸化生成ATP 的主要来源，也是脂肪酸、激素和氨基酸生物合成关键中间体的提供者[3]。线粒体在凋亡性细胞死亡中充当着关键角色，细胞在受到特定刺激后，Bcl-2 家族蛋白中的BAX、BAK 等会使线粒体外膜通透化（mitochondrial outer membrane permeabilization,MOMP），从而引发致细胞死亡的级联反应[4]。故维持一个健康的线粒体池对于细胞的生存极为重要。迄今为止，已经形成了多种维持线粒体质量的机制，包括线粒体ATP 依赖的蛋白酶途径、囊泡运输途径、线粒体的生物发生以及线粒体自噬[5]。与以上3 种途径不同，线粒体自噬属于选择性清除损伤线粒体的巨自噬，主要负责真核生物线粒体的大量降解，在线粒体质量控制中占据着核心地位。各种模型已经证明，线粒体自噬受抑制或处于异常状态均会引起受损线粒体的累积[6]。此外，线粒体自噬不单能够通过去除损伤的线粒体，而且可以通过增加新线粒体的生物合成，来改善线粒体的质量控制，即线粒体自噬途径与线粒体生物合成途径之间存在信号“串扰”[6]。例如，Shin 等[7]发现参与线粒体自噬的Parkin 相互作用底物PARIS/ZNF746 充当细胞核中的转录阻遏物，抑制线粒体生物合成重要调节剂过氧化物酶体增殖受体γ 辅激活因子1α（peroxisome proliferator-activated receptor-gamma coactivator 1 alpha, PGC-1α）的表达。基于这些结果，现在形成了一种新的观念，即通过促进线粒体自噬可以导致选择性清除受损的线粒体并同时诱导新的线粒体产生，从而改善线粒体的质量。

2 线粒体自噬途径的分子机制

线粒体自噬途径与普通的自噬有许多类似的地方，大致可分为以下几步：（1）隔离膜的起始和延伸；（2）形成包裹损伤线粒体的自噬小体；（3）自噬小体-溶酶体的融合；（4）损伤线粒体的降解。在哺乳动物中，最初的步骤包括由UNC-51 样激酶激活BECLIN1/VPS34/VPS15 复合物。在ATG5、ATG12 和ATG16L 等自噬相关蛋白（autophagy-related genes, ATGs）的辅助下，分离膜延伸，微管相关蛋白1 轻链3（microtubuleassociated protein 1 light chain 3, MAP-1LC3）Ⅰ转化为脂质化的MAP1LC3Ⅱ并进入分离膜。然后，MAP1LC3Ⅱ与线粒体外膜（outer mitochondrial me-mbrane,OMM）上的特定介质或受体蛋白相互作用，标记线粒体进行降解，同时，MAP1LC3Ⅱ仍与自噬体膜相连。故MAP1LC3Ⅱ作为受损的线粒体和自噬小体之间的桥梁，促进了线粒体被自噬小体吞噬，随后自噬小体与溶酶体融合并将线粒体运送至溶酶体中发生水解降解。在心肌细胞中，PINK1/Parkin、FUNDC1、BNIP3/NIX 和NCX 等蛋白均有表达，它们主要位于线粒体外膜上，赋予了心脏线粒体自噬的选择性，以确保受损线粒体的清除。

2.1 线粒体自噬的PINK1-Parkin 通路 线粒体生理的多个方面包括生物发生，自噬元件的运输和募集，都集中在PINK1-Parkin 途径上。PINK1 是一种主要存在于线粒体外膜的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在线粒体受损或功能障碍等情况下，线粒体膜电位减弱，蛋白水解酶活性下降、降解PINK1 减少而使PINK1 在线粒体外膜上累积，形成高分子量复合物，该复合物包括了外膜转位酶（translocase of outer membrane, TOM）复合物的成分，从而促进了Parkin 的招募[8-10]。值得注意的是，依赖PINK1 的磷酸化可改变Parkin 构象，促进其与线粒体表面的连结并触发其E3 连接酶活性[11]。除Parkin 外，其他几种泛素E3 连接酶（例如Gp78、SMURF1、SIAH1、ARIH1）也在线粒体调控中起作用[12-15]，它们一旦定位于线粒体表面，就会生成泛素链，从而触发自噬衔接蛋白的募集，其中包括了视神经蛋白（optineurin, OPTN）、核点蛋白52（nuclear dot protein 52, NDP52）和p62 等。它们可以与线粒体外膜上的泛素基团和分离膜上的MAP1LC3 结合，使线粒体锚定至自噬体。此外，PINK1-Parkin 通路可通过蛋白酶体降解线粒体融合蛋白（mitofusins,MFNs）和线粒体Rho-GTP 酶来调节线粒体动力学和运动性。具体来说，PINK1-Parkin 介导的MFN2 降解会破坏内质网-线粒体接触部位，中止线粒体的融合，使受损的细胞器与健康的线粒体网络隔离，从而促进其清除[16]。这表明内质网-线粒体接触部位可能代表了线粒体自噬的关键位点，在关键位点发生PINK1-Parkin 激活和去泛素化事件。而PINK1 同样能磷酸化线粒体Rho-GTP酶，后者能将线粒体锚定在细胞骨架上，随后Parkin 泛素化线粒体Rho-GTP 酶，从而促进其降解并抑制线粒体运输[17]。因此，阻断线粒体的运输并增强裂变可以促进线粒体自噬。

2.2 受体介导的线粒体自噬 到目前为止，已经发现了Bnip3/Nix、FUNDC1、心磷脂（cardiolipin, CL）、禁止素2（prohibitin 2, PHB2）等与线粒体自噬相关的受体蛋白，不同的受体确保了在不同组织中以及在不同刺激之后该过程的特异性。

2.2.1 Bnip3/Nix 介导的线粒体自噬 Bnip3/Nix 属于Bcl-2 家族蛋白，主要定位于细胞内膜如线粒体外膜、内质网膜上，是一种非典型的BH3-only 蛋白。Bnip3/Nix 在正常生理条件下表达量很低，而在缺氧等应激情况下表达上升[18]。Bnip3 蛋白能够通过抑制PINK1水解等机制来促进线粒体自噬[19]，这表明线粒体受体与PINK1-Parkin 通路之间存在着信号“串扰”。Marinković 等[20]发现Bnip3/Nix 的二聚体化和LIR 基序磷酸化有利于线粒体自噬的起始和进展，从而保护线粒体质量。

2.2.2 FUNDCl 介导的线粒体自噬 FUNDC1 是Liu等[21]于2012 年发现的一种由155 个氨基酸组成的哺乳动物细胞线粒体外膜受体蛋白，主要介导低氧诱导的线粒体自噬。在正常生理状态下，FUNDC1 的Tyr18 和Ser13 分别被Src 激酶和CK2 磷酸化，磷酸化的FUNDC1 与MAP1LC3 的亲和力较低；而在低氧应激或线粒体膜电位下降时，PGAM5 磷酸酶使FUNDC1 的Ser13 发生去磷酸化并增强与MAP1LC3 的相互作用，引起线粒体自噬[22]。此外，Chen 等[23]观察到FUNDC1的去磷酸化促进了FUNDC1 与视神经萎缩相关蛋白1（optic atrophy 1, OPA1）的解离以及与动力相关蛋白1（dynamin-related protein 1, DRP1）的结合，以调节线粒体融合、裂变与线粒体自噬。

2.2.3 CL 介导的线粒体自噬 在健康的线粒体中，CL位于线粒体内膜，当受到促线粒体自噬刺激时会从线粒体内膜转移至线粒体外膜，并与MAP1LC3 的CL 结合位点结合，促进自噬系统吞噬线粒体[24]。对于CL 的转位机制，Kagan 等[25]发现了六聚体膜间隙蛋白核苷二磷酸激酶D（nucleoside diphosphate kinase,NDPK-D）能结合CL 并促使其向线粒体外膜的重新分布。CL 还可以通过OPA1 的分解和释放以促进DRP1 在线粒体表面的募集来改善线粒体动力学[26]。

2.2.4 PHB2 介导的线粒体自噬 PHB2 是一种高度保守的膜支架蛋白，最近被视为能够介导线粒体自噬的新型线粒体内膜受体[27]，当线粒体外膜在蛋白酶体作用下断裂时，PHB2 能外移并与MAP1LC3 相互作用。Yan 等[28]的最新研究表明，PHB2-PARL-PGAM5-PINK1 轴是PHB2 介导的线粒体自噬的新通路。PHB2消耗会使线粒体内膜蛋白酶PARL 激活以裂解丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶PGAM5，使线粒体中的PINK1不稳定，从而阻碍Parkin、泛素和OPTN 的募集，导致线粒体自噬被抑制。

2.3 线粒体自噬与异噬的协调途径 心脏驻留巨噬细胞（cardiac resident microphages, cMacs）分布在整个心脏中，发挥着超越免疫和感染控制的多方面作用，近年来表明它能够调节异噬与自噬的活动来维持心肌细胞线粒体的稳定性。Nicolás-Ávila 等[29]发现每个心肌细胞周围平均有5 个cMacs，且每个cMac 可以与多达5 个心肌细胞相互作用。他们利用CD169DTR小鼠清除了心脏中的cMacs，观察到一种被称为exopher 的转移囊泡在细胞外积累导致了NLRP3 炎性小体的激活，进而抑制线粒体自噬，最终又会使exopher 外移逐渐减少。而通过敲除Atg7 及应用自噬诱导剂雷帕霉素分别减少和增加了exopher 的产生及线粒体的转移以供cMacs 吞噬。值得注意的是，Nicolás-Ávila 等[29]进一步发现了酪氨酸激酶受体Mertk 介导了该吞噬作用。

3 线粒体自噬与DCM

糖尿病的心血管并发症是糖尿病患者病情加重和死亡的主要原因之一，这些并发症包括DCM（其特征是左心室重构）和无冠心病的心力衰竭[30]。有证据表明，糖尿病的心血管并发症集中在线粒体是因为它是心脏心肌损伤的“震中”[31]。由于目前糖尿病患者与非糖尿病患者的心肌病治疗方法几乎没有区别[32]，因此重要的是找到针对这种病因或发病机制的特定治疗方法。

3.1 1 型和2 型糖尿病心脏中的线粒体自噬 如前所述，心脏使用的大部分能量都来自线粒体中的脂肪酸氧化。在糖尿病心脏中，葡萄糖利用减少，脂肪酸成为主要的能量来源，从而产生更高水平的氧化应激并可能引起线粒体损伤或功能障碍。受损的线粒体释放的ROS 和死亡诱导因子也会增加心肌细胞的损伤[33-34]。在单次大剂量链脲佐菌素（streptozocin, STZ）诱导的1 型糖尿病背景下，心脏组织中自噬的几个核心成分如MAP1LC3、ATG5 和ATG12 的水平降低[35]。同时，PINK1 和Parkin 蛋白水平均降低，但BNIP3 水平保持不变，表明了1 型糖尿病模型中特定的线粒体自噬信号改变[35-37]。这一发现提示尽管有广泛的线粒体功能障碍，但DCM 中的特定线粒体自噬信号会减少，导致功能障碍线粒体在心脏水平的积聚，并加剧了对心脏的损害。然而，在2 型糖尿病的背景下，已经报道了相反的观察结果：在接受了高脂饮食的小鼠中，心肌细胞自噬流最初会增加，但在2 个月后会降低；同时，Mito-Keima 信号和定位到线粒体的MAP1LC3Ⅱ增加，这表明高脂饮食后线粒体自噬增加[38]。此外，删除ATG7 或Parkin 会导致应对高脂饮食的线粒体自噬受损以及心脏舒张功能障碍加重，而Beclin1 过表达则有相反的效应[38]。该证据指出了在肥胖相关的DCM 中自噬和线粒体自噬的保护性作用。综合以上结果，可推断线粒体自噬在DCM 的1 型糖尿病模型中被抑制而在2 型糖尿病模型中被激活。

3.2 影响线粒体自噬的DCM 的治疗 糖尿病和DCM有多种治疗方案可供选择，其中一些疗法可影响线粒体自噬状态，下面重点总结近几年研究较热门的几种药物。

3.2.1 钠-葡萄糖协同转运体2 抑制剂（sodium-glucose cotransporter 2 inhibitors, SGLT2i）恩格列净是一种SGLT2i，其除了降血糖作用之外，还具有心脏保护作用。Zhou 等[39]的研究表明，恩格列净可能通过激活MAPK，限制Drp1 的活化，抑制糖尿病诱导的线粒体裂变，进而使线粒体自噬受到抑制。一方面，恩格列净诱导的裂变减少可能通过抑制线粒体ROS 的氧化应激使心脏微血管内皮细胞（cardiac microvascular endothelial cells,CMECs）的活性和屏障功能得到改善；另一方面，由于F-肌动蛋白的稳态作用，恩格列净诱导的内皮细胞迁移可能促进血管生成。

3.2.2 尿石素（Urolithin, U）A 和B UA 是存在于石榴等水果和坚果中的鞣花单宁经肠道菌群产生的一种天然代谢产物，已在线虫和小鼠等多个模型中证明了其线粒体自噬作用。周友等[40]的研究发现，UA 治疗可明显提高糖尿病小鼠心脏中与线粒体结合的p62 及MAP1LC3Ⅱ含量，促进线粒体与溶酶体融合，使细胞内极性受损线粒体含量降低，改善了心脏舒张功能障碍、减少了间质胶原蛋白沉积。而在使用线粒体自噬抑制剂Mdivi-1 后，上述效果被逆转，表明线粒体自噬介导了UA 的保护作用。另外，Savi 等[41]的研究表明，体内UA 和UB 治疗可以降低心肌中约30%促炎症细胞因子Fractalkine 的表达，并且可以预防糖尿病大鼠高血糖3 周后器官和细胞分子水平上出现心功能障碍的早期体征。

3.2.3 褪黑素 褪黑素是一种主要在脑松果体分泌的吲哚类激素，因调节昼夜节律、改善睡眠而被人熟知，近年来有望成为治疗糖尿病的药物。Wang 等[37]研究发现，褪黑素能够促进线粒体自噬改善DCM 的损伤。实验中，褪黑素增强了高糖处理组心肌细胞MAP1LC3Ⅱ的表达以及线粒体与溶酶体的共定位，并且能抑制Mst1 的磷酸化，而敲除Parkin 基因则抵消了褪黑素对糖尿病心肌线粒体形态和能量代谢的有益作用。这些结果表明，褪黑素通过抑制Mst1 增强Parkin 介导的线粒体自噬来改善DCM。Yu 等[42]则证明长期的褪黑素治疗通过改善线粒体质量控制，延缓DCM 的进展，降低了心肌对缺血再灌注损伤的敏感性。褪黑素膜受体介导的SIRT6-AMPK-PGC-1α-AKT 轴在这一过程中起到了关键作用。

4 小结

DCM 的机制目前仍未明确阐明，而线粒体自噬能通过清除异常的线粒体、减少ROS 恶性循环等参与DCM 的发生、发展及转归。未来相关机制如受体介导的线粒体自噬、cMacs 协调清除受损线粒体的进一步阐明和影响线粒体自噬状态药物的揭示将有望为糖尿病及其DCM 的防治带来新的靶点和针对性治疗方案。