异功散防治幼鼠哮喘短链脂肪酸-G蛋白偶联受体43作用机制研究

林晓玲 周 娟 叶丽妍 陈佩文 叶绮娜 刘 华 陈晓刚

(1 广州中医药大学第一临床医学院,广州,510405; 2 广州中医药大学第一附属医院儿科,广州,510405; 3 广州妇女儿童医疗中心,广州,510623)

支气管哮喘(简称哮喘)是儿童时期最常见的慢性呼吸道疾病,近年来儿童哮喘患病率在全球范围内持续上升,其具体原因尚未完全清楚。Strachan提出的“卫生假说”,从生命早期微生物暴露的角度,解释现代社会中哮喘等过敏性疾病发病率持续增加的现象,得到了很多证据的支持。目前认为,除基因、社交、经济和文化背景外,生命早期的足够的微生物暴露“训练”了固有和适应性免疫系统,进而实现机体炎症、抗炎和免疫耐受之间的平衡。其中,肠道内栖息着数量和种类最为庞大的微生物群体,对生命早期机体免疫耐受的建立至为重要[1]。益生菌(如双歧杆菌、乳杆菌、酪酸梭菌等)及肠道菌群的代谢产物尤其是短链脂肪酸(Short-chain Fatty Acids,SCFAs),均被发现能减轻哮喘模型小鼠的过敏性炎症和气道高反应性[2-3]。在既往研究中,我们成功建立了幼年期BALB/c小鼠的哮喘模型,并发现异功散的早期干预能显著减轻哮喘模型幼鼠的气道炎症反应[4]。本实验在此基础上,试图探索异功散是否通过影响肠道菌群代谢产物SCFAs,进而作用于G蛋白偶联受体43(G-protein-coupled Receptor 43,GPR43)从而抑制过敏性气道炎症。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 7 d鼠龄无特定病原体(Specific Pathogen Free,SPF)级BALB/c雌性小鼠共32只,体质量(5.26±1.15)g。由广州中医药大学实验动物中心提供,许可证号:SYXK(粤)2018-0034,饲养于广州中医药大学第一附属医院实验动物中心SPF级环境中。伦理审批号:TCMF1-2020007,TCMF1-2018019。

1.1.2 药品 氢氧化铝粉(上海麦克林生化科技有限公司,批号:20180411);鸡卵清蛋白(Ovalbumin,OVA)(Sigma公司,批号:BC88709X);异功散组成:人参(批号:180901)、白术(批号:180801)、茯苓(批号:181104)、广陈皮(批号:180701)、炙甘草(批号:181001),均购自广州中医药中大学第一附属医院,将以上药材按1∶1∶1∶1∶1比例配制,制成含生药质量浓度为2 g/mL的溶液;酪酸梭菌CGMCC313-1(山东科兴生物制品有限公司惠赠,批号:LS2021030)。

1.1.3 试剂与仪器 乙酸(Sigma-Aldrich,美国,批号:64-19-7),丙酸(Sigma-Aldrich,美国,批号:79-09-4),丁酸(Sigma-Aldrich,美国,批号:107-92-6),2-乙基丁酸标准品(Sigma-Aldrich,美国,批号:88-09-5);丙酮(色谱纯,天津红岩公司,批号:20180701);细胞裂解液(Radio Immunoprecipitation Assay,RIPA)(强,上海碧云天生物技术有限公司,编号:P0013B),蛋白酶抑制剂[苯甲基磺酰氟(Phenylmethanesulfonyl Fluoride,PMSF)](上海碧云天生物技术有限公司,编号:ST506),二辛可酸(Bicinchoninic Acid,BCA)蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司,编号:P0009);衍生化试剂(含有1% t-BMCS in MTBSTFA,Cerilliant公司,美国,批号:FN0111)。电泳仪(Mini-PROTEAN Tetra电泳装置,BIO-RAD公司,美国,型号:1658001)、酶标仪(Model 550,BIO-RAD公司,美国,型号:1681130),高速冷冻离心机(赛默飞世尔科技公司,型号:Legned Micro 17R),气相质谱联用仪器(安捷伦公司,型号:7890B-5977A)。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 采用随机数字表法将实验动物分为空白组、模型组、中药组(异功散)和益生菌组(酪酸梭菌),每组8只,分笼饲养。参照既往研究方法制备哮喘幼鼠模型[4]。模型组、中药组和益生菌组幼鼠分别于第1、13天腹腔注射0.2 mL OVA致敏液(质量分数为10%OVA溶液0.1 mL与等体积佐剂液态铝混合),并于第19天以3% OVA溶液雾化吸入激发,1次/d,20 min/次,连续激发6 d,幼鼠出现烦躁不安、腹部凹陷、搔耳挠鼻、弓背为阳性反应。空白组以腹腔注射以及雾化吸入等量生理盐水激发。

1.2.2 给药方法 从造模起始日至雾化激化前1 d(实验第1天至第18天),空白组和模型组幼鼠则给予磷酸缓冲盐溶液(Phosphate Buffered Saline,PBS),中药组幼鼠给予异功散煎液,益生菌组给予浓度为5×108CFU/mL的酪酸梭菌溶液。每只幼鼠的给药量均为0.2 mL体积溶液。共18 d,1次/d。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 GC-MS/MS法检测血清SCFAs 摘幼鼠眼球取血,离心分离血清(3 000 r/min,离心半径4.5 cm,15 min),按照相关文献血清样本前处理方法进行相应提取,干燥,衍生[5]。检测条件如下。1)内参:2-乙基丁酸。2)氦气为载气,柱流量1.0 mL/min。3)升温程序:50 ℃(0～3 min)～60 ℃(3～3.5 min)～250 ℃(3.5～8.5 min)～110 ℃(8.5～11 min)～250 ℃(11～12 min)。4)气相色谱条件:进样口温度250 ℃,进样量1 μL,分流比10∶1。5)质谱条件:电子轰击源(Electron Impact Source,EI),辅助加热器温度250 ℃,离子源温度230 ℃,Scan扫描范围m/z 50～200。对物峰面积与内标峰面积进行定量,使用Agilent GC MSD Chemstation软件进行数据分析。

1.2.3.2 肺组织GPR43表达的检测 分离幼鼠肺组织,取适量加入蛋白酶抑制剂PMSF的RIPA强裂解液充分裂解,1 400 r/min,4 ℃,离心15 min(离心半径4.5 cm)。取1.2 mL蛋白标准配制液置于蛋白标准管中充分混匀得到蛋白标准溶液(BCA),浓度为25 mg/mL。向孔板中加入适量体积的BCA液,置于恒温摇床上(37 ℃)温育30 min,在酶标仪上测定A562波长的吸光度,使用EXCEL计算标准曲线并根据组织样本的体积计算相应的蛋白浓度。参照参考文献[6],通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳得出各组GPR43相对浓度。

2 结果

2.1 SCFAs

乙酸、丙酸、丁酸、2-乙基丁酸的保留时间分别约为4.80 min、6.22 min、7.57 min、9.16 min。所有目标峰均与杂质分离,分离度良好,方法适用。总离子流图谱结果见图1。

图1 SCFAs总离子流图谱

2.1.1 异功散对幼鼠血清SCFAs中乙酸含量的影响 与空白组比较,模型组血清乙酸含量、乙酸相对比值均有所升高,但差异均无统计学意义(均P>0.05);与模型组比较,中药组、益生菌组血清乙酸含量皆高于模型组,但差异均无统计学意义(均P>0.05),而血清乙酸相对比值的增高,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1,图2～3。

表1 异功散对幼鼠血清乙酸含量的影响(n=8)

图2 血清SCFAs中乙酸含量

图3 血清SCFAs中乙酸相对比值

2.1.2 异功散对幼鼠血清SCFAs中丙酸含量的影响 与空白组比较,模型组血清丙酸含量、丙酸相对比值均降低,但差异均无统计学意义(均P>0.05);与模型组比较,中药组、益生菌组血清丙酸含量均低于模型组,丙酸相对比值均低于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2,图4～5。

表2 异功散对幼鼠血清丙酸含量的影响(n=8)

图4 血清SCFAs中丙酸含量

2.1.3 异功散对幼鼠血清SCFAs中丁酸含量的影响 与空白组比较,模型组血清丁酸浓度、丁酸相对比值均降低,但差异无统计学意义(P>0.05);与模型组比较,中药组、益生菌组血清丁酸浓度、丁酸相对比值均低于模型组,但差异无统计学意义(P>0.05)。见表3,图6～7。

表3 异功散对幼鼠血清丁酸含量的影响(n=8)

图6 血清SCFAs中丁酸含量

图7 血清SCFAs中丁酸相对比值

2.1.4 异功散对幼鼠血清总SCFAs含量的影响 模型组血清总SCFAs含量高于空白组,但差异无统计学意义(P>0.05);中药组、益生菌组血清总SCFAs含量皆高于模型组,但差异均无统计学意义(均P>0.05)。见表4,图8。

表4 异功散对幼鼠血清总SCFAs含量的影响

图8 总SCFAs含量

2.2 异功散对幼鼠肺组织GPR43的影响 模型组肺组织GPR43表达量高于空白组,但差异无统计学意义(P>0.05)。中药组肺组织GPR43表达量高于模型组,差异有统计学意义(P<0.05);益生菌组肺组织GPR43表达量则低于模型组,但差异无统计学意义(P>0.05)。见表5,图9～10。

表5 异功散对小鼠肺组织GPR43相对表达量的影响(M/P25～P75,n=8)

图9 GPR43相对表达量

图10 蛋白电泳条带图

2.3 血清乙酸浓度与肺组织GPR43的相关性分析 幼鼠血清乙酸浓度及肺组织GPR43表达之间,不存在显著的相关关系(r=0.227,P>0.05)。见图11。

图11 血清乙酸浓度与肺组织GPR43的相关性分析散点图

3 讨论

元代医家朱震亨首创“哮喘”病名,并阐明其病理因素“专主于痰”。培土生金被认为是防治小儿哮喘的重要方法,这与“痰”的生成原因、小儿“脾常不足”的特点相符。异功散为北宋名医钱乙所制名方,方中人参、白术、茯苓、炙甘草、陈皮5药相合,共奏健脾益气和胃之功。现代药理研究发现,方中主要药物的活性成分,如橘皮素、橙皮苷、人参皂苷Rh2等,能减轻哮喘模型动物肺组织炎症,或降低其气道高反应性,抑制Th2、Th17细胞增殖及相关炎症介质分泌等[7-8]。

现代医学认为,哮喘是一种以气道高反应性为特征的慢性炎症反应,其发病为基因和环境相互作用所致,具体机制可能与Th1/Th2细胞失衡、Th17/Treg细胞(调节性T细胞)失衡等相关[9-10]。近年来越来越多的证据表明,肠道菌群与哮喘特别是婴幼儿过敏性哮喘密切相关,肠道菌群失调可能是导致哮喘发生的重要机制之一[11-12]。SCFAs是由肠道细菌发酵机体无法消化的纤维和氨基酸所产生,主要成分为乙酸、丙酸和丁酸,占所有SCFAs含量95%以上,其含量比例通常为3∶1∶1[13]。SCFAs既是肠道黏膜细胞的主要能量来源,也是重要的免疫信号因子,可抑制炎症介质的产生[14],研究发现,其代谢紊乱与过敏性疾病密切相关[15-16]。THORBURN等[2]的研究证明,高纤维食物可促使小鼠肠道菌群产生更多的SCFAs,并减少其后代过敏性气道疾病的发生,其主要作用成分可能是乙酸,丙酸则主要被结肠上皮细胞吸收利用[3]。本研究结果中,中药组及益生菌组的血清总SCFAs含量,与模型组比较虽无明显差异,但血清乙酸浓度有上升趋势,丙酸浓度则显著减低,乙酸相对于总SCFAs比值的升高差异有统计学意义(P<0.05),仍提示异功散及可能影响肠道菌群代谢产生SCFAs特别是其成分乙酸。

SCFAs主要为通过抑制组蛋白去乙酰化酶和激活GPR如GPR41、GPR43和GPR109a等来调节代谢和免疫[17]。一项临床研究表明,哮喘患者在服用产SCFAs的可溶性纤维粉后,其气道炎症减轻,痰中GPR43基因表达较对照组显著上调[18]。动物实验亦发现,敲除GPR43后小鼠表现出剧烈的过敏性气道炎症反应[19-20],而乙酸可激活GPR43并减轻支气管哮喘小鼠的过敏性气道炎症反应[19]。本实验结果显示,用异功散防治的哮喘幼鼠肺组织中GPR43相对表达量显著高于模型组(P<0.05),而酪酸梭菌则无此作用。相关分析的结果表明,幼鼠血清乙酸浓度与肺组织GPR43表达水平之间并无显著相关性,提示异功散上调幼鼠肺组织GPR43表达的作用,并非受其对SCFAs的影响。值得注意的是,GPR43在组织中的分布具有很强的特异性,例如,Treg细胞能有效抑制机体的过敏性炎症反应,但迄今只在肠道的Treg细胞上发现有GPR43表达,其他部位包括肺则未能发现,这也说明异功散所影响的幼鼠肺组织GPR43,应该来源于其他炎症细胞,如中性粒细胞、巨噬细胞、Th1细胞等,但其确切机制,仍需要进行一步研究。

综上所述,本研究结果表明,异功散的早期干预可能影响了哮喘幼鼠肠道菌群的SCFAs代谢,并上调了肺组织GPR43表达,但二者的作用无显著相关性。

利益冲突声明:无。