静心止动方治疗小儿抽动障碍靶点的体外研究

田 雪 胡少朴 欧光银 王春辉 高 磊 韩 斐

(1 中国中医科学院广安门医院,北京,100053; 2 北京中医药大学东方医院,北京,100078)

抽动障碍(Tic Disorders,TD)是儿童时期起病的神经精神性疾病,主要表现为突然的、快速的、反复的、无节奏的一个或多个部位肌肉运动性抽动和(或)发声性抽动,其发病率为0.4%～3.8%,并且有逐年上升的趋势[1]。TD患儿病情反复迁延难愈,易伴发多种精神疾病,严重影响儿童及青少年的身心健康和生长发育,给家庭带来巨大的经济和心理负担[2]。自身免疫失衡引起的大脑神经炎症反应是TD发病的重要原因,越来越多的研究提示脑内免疫吞噬细胞(小胶质细胞)的过度活化介导的脑神经炎症反应参与TD的发病过程[3]。

课题组认为TD的核心病机为心神失养、内外风动,以从心论治、肝肺同调为治疗大法,在古方琥珀散化裁的基础上创立院内制剂静心止动方,经十余年反复临床验证疗效显著,能够缓解TD患儿的症状,显著提高其生命质量,并在安全性方面体现出较大优势[4-6],但目前尚缺乏静心止动方治疗TD的作用机制探讨。本研究拟从网络药理学的角度探讨静心止动方治疗TD的潜在作用机制,并通过体外细胞实验进行验证,以期为静心止动方临床治疗TD提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 静心止动方活性成分筛选及靶点预测 通过中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP,https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php),以口服生物利用度(Oral Bioavailability,OB)≥30%和 Likeness,DL)≥0.18为筛选条件,分别获取百部、板蓝根、北沙参、柴胡、藁本、蔓荆子、木蝴蝶、酸枣仁、辛夷的活性成分;鉴于TCMSP数据库暂未收录方中天麻的相关活性成分数据,所以我们从中医药百科全书(The Encyclopedia of Traditional Chinese Medicine,ETCM,http://www.tcmip.cn/ETCM/index.php/Home/Index/)数据库获取天麻的活性成分。将上面获取的中药各种活性成分,导入PubChem数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)获得各成分的canonical SMILES序列号,然后将序列号导入SwissTargetPrediction数据库(http://swisstarget prediction.ch/)中,限定物种为“Homosapiens”,以“probability”>0为筛选条件,以预测各活性成分的作用靶点。

1.2 TD靶点的预测 利用关键词“Tic Disorders”从以下数据库中收集疾病相关靶点:GeneCards(https://www.genecards.org/),人类孟德尔遗传数据库(Online Mendelian Inheritance in Man,OMIM,https://www.omim.org/),治疗性靶标数据库(Therapeutic Target Database,TTD,http://db.idrblab.net/ttd/),PharmGkb(https://www.pharmgkb.org/)和DisGeNET(https://www.disgenet.org/)。然后利用jvenn(http://jvenn.toulouse.inra.fr/app/index.html)获得交集靶点,即为TD相关靶点。

1.3 构建中药-活性成分-疾病靶点网络 将各中药和TD的靶点导入jvenn平台,二者交集靶点作为静心止动方治疗TD的潜在作用靶点。运用Cytoscape 3.8.0软件(https://cytoscape.org/)建立中药-活性成分-疾病靶点网络。

1.4 蛋白质-蛋白质相互作用(Protein-protein Interaction,PPI)网络的构建及核心靶点筛选 将静心止动方和TD的交集靶点导入STRING 11.5数据库(https://cn.string-db.org/),限定物种为Homosapien”,并以最低互作分数为中度可信度(0.4分)为条件,构建PPI。将得到的PPI网络的数据以.tsv格式保存,导入Cytoscape 3.8.0软件进行可视化分析,然后使用软件的内置插件CytoNCA计算该PPI网络的中间性中心性(Betweenness Centrality,BC)、紧密性中心性(Closeness Centrality,CC)、程度中心性(Degree Centrality,DC)、特征向量中心性(Eigenvector Centrality,EC)、网络中心性(Network Centrality,NC)和局部平均连通性(Local Average Connectivity,LAC)参数用于评估PPI网络节点的拓扑属性,随后以各参数的中位值为筛选条件,筛选得到静心止动方治疗TD的核心靶点。

1.5 核心靶点通路注释分析 使用R 4.1.3软件的clusterProfiler包对上述得出的核心靶点进行基因本体(Gene Ontology,GO)功能富集分析和基于京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析,以P<0.05为差异有统计学意义。然后使用enrichplot包对分析结果进行可视化,使用ggplot2包绘制图片。然后在KEGG数据库(https://www.genome.jp/kegg/)对相关通路进行分析。

1.6 细胞实验验证

1.6.1 材料

1.6.1.1 细胞 小鼠BV2小胶质细胞(上海富衡生物科技有限公司,货号:FH0355),使用DMEM培养基(含有10%FBS和1%双抗)置于细胞培养箱(37 ℃,5%CO2)中常规培养。

1.6.1.2 药物 静心止动方颗粒剂(酸枣仁12 g、珍珠粉0.9 g、柴胡9 g、天麻9 g、辛夷9 g、藁本9 g、蔓荆子9 g、木蝴蝶6 g、板蓝根9 g、百部9 g、北沙参9 g)由北京中医药大学东方医院提供。参考既往文献[7],药品制备时取2付药量,共180 g,加水浓缩至180 mL,获得1 g/mL分装至离心管,1 500 r/min,离心半径12.5 cm,离心25 min,取上清液,0.22 μm筛网过滤除菌,-20 ℃保存以供后续细胞实验。

1.6.1.3 试剂与仪器 BCA蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司,货号:P0010S);磷酸化磷脂酰肌醇3激酶(Phosphorylated Phosphoinositide 3-kinase,p-PI3K)抗体(BIOSS,货号:BS-5570R);磷脂酰肌醇3激酶(Phosphoinositide 3-kinase,PI3K)抗体、磷酸化蛋白激酶B(Phosphorylated Protein Kinase B,p-AKT)抗体和蛋白激酶B(Protein Kinase B,AKT)抗体(Cell Signaling Technology,美国,货号分别为4257、4060和4691);β-actin抗体(Boster,美国,货号:BM3873);740 Y-P(MedChemExpress,美国,货号:HY-P0175);脂多糖LPS(Solarbio,货号:L8880);特超敏ECL化学发光试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司,P0018AS);放射免疫沉淀测定(Radio Immunoprecipitation Assay,RIPA)裂解液(上海碧云天生物技术有限公司,P0013B)等。Multiskan酶标仪(Bio-Rad公司,美国,型号:Go1510);ChemiDocMP成像和分析系统(Bio-Rad公司,美国,型号:1708283)。

1.6.2 方法

1.6.2.1 BV2细胞活化模型建立 用聚丁二酸丁二醇酯(Poly Butylenes Succinate,PBS)配制1 mg/mL脂多糖母液,于-20 ℃冰箱避光保存。以2×104个细胞/孔的浓度将BV2细胞接种到6孔板中,待细胞量长至80%时,加入脂多糖(终浓度1 μg/mL)共同孵育,药物作用24 h以使BV2细胞达活化状态[8]。

1.6.2.2 细胞分组及干预方法 将活化的BV2细胞分为4组:1)脂多糖组用无血清培养基干预24 h;2)740Y-P组用25 μg/mL 740Y-P干预24 h;3)JXZDF组用25 mg/mL JXZDF干预24 h(给药浓度参考文献[9]);4)JXZDF+740 Y-P组用25 μg/mL 740Y-P+25 mg/mL JXZDF联合干预24 h。

1.6.2.3 蛋白质免疫印迹法检测PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、β-actin蛋白的表达水平 使用RIPA裂解液冰上裂解细胞30 min,收集裂解液于离心管内,4 ℃、15 000 r/min,离心半径12.5 cm,离心20 min,收集上清液,并采用二辛可宁酸(Bicinchoninic Acid,BCA)法进行浓度检测。将各组蛋白浓度配平并变性,进行SDS-PAGE凝胶电泳,转膜100 min,5%牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin,BSA)室温封闭1 h。按抗体说明书加入最优比例一抗,4 ℃冰箱孵育过夜。第2天用洗膜缓冲液(Tris Buffered Saline-Tween 20,TBST)洗膜3次,10 min/次。加入相应种属二抗,室温孵育1 h,TBST洗膜3次,10 min/次。采用增强型化学发光(Enhanced Chemiluminescence,ECL)法显影,将图片导入ImageJ软件中进行定量分析。

1.6.2.4 统计学方法 采用GraphPad Prism软件进行数据分析,组间显著性检验采用单因素方差分析,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 静心止动方活性成分及靶点 共获取静心止动方活性成分173个。共收集到静心止动方中153个活性分子的潜在靶点1 175个。

2.2 静心止动方治疗TD潜在靶点 得到2 693个TD相关靶点。共得到交集靶点291个。见图1。

图1 TD靶点韦恩图和静心止动方与TD交集靶点韦恩图

2.3 中药-活性成分-疾病靶点网络 所构建的中药-活性成分-疾病靶点网络模型共涉及447个节点,以及3 780条边,不同颜色及形状分别代表静心止动方的药物、活性成分以及治疗TD的潜在靶点。其中黄色菱形代表药物,紫色矩形代表活性成分,蓝色圆形代表作用靶点,其Degree越大,则节点形状越大。见图2。选取到Degree前5的活性成分主要为槲皮素、豆甾醇、高车前素、β-谷甾醇、山柰酚等。见表1。

表1 度值前5的活性成分

图2 静心止动方治疗TD的“药物-成分-靶点-疾病”网络

2.4 PPI网络及核心靶点 结果显示有291个节点,3 670条边,平均节点度值为25.2。见图3。筛选核心靶点过程及各参数阈值见图4。最后得到28个核心靶点。见表2。

表2 28个核心靶点及其度值

图3 静心止动方与TD交集靶点PPI网络

图4 PPI网络拓扑分析核心靶点流程

2.5 GO和KEGG通路富集分析 通过对28个核心靶点的富集分析,最后得到GO富集条目共有1 893条,其中生物过程(Biological Process,BP)1 760条,细胞组分(Cellular Component,CC)51条,分子功能(Molecular Function,MF)82条。BP排名靠前的有神经胶质细胞分化、胶质细胞再生、肽基-丝氨酸磷酸化、肽基-丝氨酸修饰、神经元死亡等;CC排名靠前的有早期内体、膜筏、膜微结构域、谷氨酸能突触、晚期内体等;MF排名靠前的有磷酸酶结合、RNA聚合酶Ⅱ-特异性DNA结合转录因子结合、蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性、脱氧核糖核酸-结合转录因子结合、蛋白磷酸酶结合等。KEGG富集通路分析条目有158条。BP,CC,MF各排名前10的GO条目和排名前20的KEGG相关通路见图5。结果提示,PI3K/AKT信号通路可能是静心止动方治疗TD的关键通路,预测相关作用靶点为AKT1、MAPK3、IL6、TP53、EGFR、MTOR、VEGFA、MAPK1、NTRK2、ERBB2、RELA、GSK3B、MAP2K1、ERBB4。见图6。

图5 GO和KEGG富集分析气泡图

2.6 细胞实验结果 740 Y-P组和静心止动方组分别与脂多糖组比较,结果显示,PI3K激动剂740 Y-P组可提高PI3K/p-PI3K和AKT/p-AKT蛋白表达水平,静心止动方组抑制BV2细胞PI3K/p-PI3K、AKT/p-AKT蛋白的表达,而当联合应用740 Y-P时,静心止动方的抑制效应被逆转。见图7。

图7 免疫组化检测各组PI3K/AKT通路关键蛋白表达注:与模型组比较,**P<0.01,***P<0.001;与对照组比较,△△P<0.01,△△△P<0.001

3 讨论

韩斐教授从临床实践中发现,患有TD的患儿或多或少均存在性格内向、执拗,脾气暴躁易怒,甚至狂躁的性格特点,这种情绪问题出现在抽动症状出现之前,并且贯穿疾病的整个过程。而“心为脏腑之主,而总统魂魄,并骇意志”(张介宾《类经》),患儿长期存在情绪问题,耗伤心血,会导致心神失养,统领失权,而五志各异;故心神失养是导致患儿出现抽动症状的病理基础,而症状的易于变化、易于反复,是肝阳风动或肝血不足,导致肝风内动的表现;心肺同属上焦,患儿心血亏虚,日久伤及肺阴、肺气,致使易感外邪而至肺窍不利,鼻咽症状突出,而成为抽动症状发生的重要诱因。据此,韩斐教授总结出“从心论治,肝肺同调”的治疗大法,创立静心止动方(由酸枣仁、珍珠粉、柴胡、天麻、辛夷、藁本、蔓荆子、木蝴蝶、板蓝根、百部、北沙参等11味药物组成)[10],方中以珍珠粉、酸枣仁宁心安神为君,天麻、柴胡疏肝解郁为臣,加以疏风解表之藁本、蔓荆子等,全方共奏宁心安神、祛风疏肝之功。课题组前后进行了持续而多维度的临床研究[4-6,10-20],从不同角度证实了静心止动方治疗TD的临床疗效,发现其在改善运动性抽动和发声性抽动的次数、频率及总损害率方面明显优于西药,同时能改善TD患儿心理情绪症状,显著提高其生命质量,并在安全性方面体现出较大优势。

本研究首先采用网络药理学的方法,以静心止动方与TD为研究对象,通过数据库与文献索引获得交集靶点,借助PPI网络预测静心止动方治疗TD的活性成分及潜在的分子靶点。最后通过信号通路富集分析,将研究的重点聚焦在了PI3K/AKT信号通路上。

TD作神经精神类疾病,严重影响儿童身心健康,虽然TD的发病机制不清,但自身免疫失衡引起的大脑神经炎症反应是重要的一种假说。作为“脑内吞噬细胞”,小胶质细胞发挥免疫与神经的交互作用,在TD的发病过程中起到重要作用。2016年LENNINGTON等[21]对TD患者尸检后脑组织的研究发现,TD患者脑尾状核区小胶质细胞异常活化,研究同时采用基底神经核区脑组织RNA测序的方法,发现这些区域同样存在过度活化的小胶质细胞分泌的炎症介质的高表达。因此TD患者脑中存在异常活化的小胶质细胞,同时分泌炎症介质,这些炎症介质作为重要的神经炎症调节分子,起到神经与炎症之间的交互作用,是中枢神经系统炎症反应的主要参与者,可以增加血脑屏障的通透性,诱发自身免疫,促进神经递质的异常释放,进而导致TD的发病。

PI3K/AKT信号可能参与TD发病。研究表明,PI3K/AKT/NF-κB通路在DOI诱导的TD动物模型中被激活,而LY294002(一种PI3K抑制剂)治疗后不仅减轻了TD动物的症状,同时也减少了PI3K/AKT/NF-κB介导的神经炎症[22],其关键靶标亦被证实与神经精神疾病有关,主要作用包括促进神经营养因子释放,调控谷氨酸能系统功能,抑制海马神经元凋亡,改善线粒体功能异常,调节糖和脂质代谢紊乱,促进脑血管新生等。PI3K/AKT信号通路调控小胶质细胞活化介导的神经炎症的研究越来越多,其中最具总结性的文献[3]综述指出,在神经炎症的发生过程中,PI3K通路发挥了至关重要的作用,PI3K的激活/沉默直接影响小胶质细胞M1/M2极化平衡状态,即发挥促炎还是抗炎效应,这对于神经系统的保护尤为重要。

本研究通过体外实验验证静心止动方是否通过PI3K/AKT信号通路发挥TD的治疗作用,为此研究选择了活化的小胶质细胞作为研究对象,旨在模拟TD患儿大脑神经炎症反应状态。在静心止动方干预后,小胶质细胞中PI3K/p-PI3K、AKT/p-AKT蛋白的表达水平下调。为进一步证实该信号通路的存在,本研究进一步加用了PI3K激动剂作为合并用药,从结果中也可以看出,PI3K激动剂740 Y-P上调了PI3K/p-PI3K、AKT/p-AKT蛋白的表达,740 Y-P与静心止动方联合干预后,静心止动方对PI3K/AKT信号通路的抑制效应被逆转,提示PI3K/AKT信号通路参与了静心止动方治疗TD的生物过程。

综上所述,本研究通过网络药理学和体外细胞实验证实,静心止动方的主要活性成分为槲皮素、豆甾醇、高车前素、β-谷甾醇、山柰酚等,其通过PI3K/AKT信号通路调控纹状体小胶质细胞过度活化,抑制大脑神经炎症反应,从而发挥TD治疗作用。从上述主要活性成分的药物来源来看,柴胡和蔓荆子在本方中的意义较为重大,在临床应用中可考虑适当加大用量,而二者与TD的具体量效关系待于进一步研究。本研究为阐释“心神失养、内外风动”的TD病机、“从心论治、肝肺同调”的治疗大法提供了生物学线索和依据,为下一步开展高级别临床研究提供了实验支持。

利益冲突声明:无。