UHPLC-MS/MS法测定瑞戈非尼中两种痕量基因毒性杂质

陈爽,刘柱,石云峰,朱价,罗英

(浙江省食品药品检验研究院,浙江 杭州 310058)

基因毒性杂质(或遗传毒性杂质,genotoxic impurity, GTI)是少量即能引起细胞DNA损伤,诱导基因突变,并具有致癌倾向的化合物[1]。欧洲药品管理局(EMEA)、美国食品药品管理局(FDA)及人用药品注册技术要求国际协调会(ICH)先后颁布了基因毒性杂质控制的指导文件[2-4],推荐以毒理学关注阈值(TTC,1.5 μg·d-1)来控制用药风险,并发布基因毒性警示结构基团。

瑞戈非尼(Regorafenib)是拜耳药业研发并于2017年3月在国内上市的一种新型口服多靶点的磷酸激酶抑制剂,本品以促进肿瘤血管生成和细胞增殖的多种蛋白激酶为靶标,达到治疗晚期及转移性结肠癌、进展期肝细胞癌、胃肠道恶性间质肿瘤、儿童神经母细胞瘤和胶质母细胞瘤及一些转移性实体肿瘤的目的。瑞戈非尼的合成路线中起始物料SM2、SM3结构中均含有苯胺类基因毒性警示结构基团,具有潜在基因毒性,详见图1。

A.3-氟-4-氨基苯酚(SM2);B.3-三氟甲基-4-氯异氰酸苯酯(SM3)

SM2[3-氟-4-氨基苯酚(3-Fluoro-4-aminophenol)];SM3[3-三氟甲基-4-氯异氰酸苯酯(3-trifluoromethyl-4-phenylchloroisocyanate)]

SM2[3-氟-4-氨基苯酚(3-fluoro-4-aminophenol)];SM3[3-三氟甲基-4-氯异氰酸苯酯(3-trifluoromethyl-4-phenylchloroisocyanate)]

瑞戈非尼已收载于《中国药典》和《欧洲药典》,已经报道了一种LC-MS/MS法定量同时测定肝细胞癌患者血浆中瑞戈非尼中及其两种活性代谢物的含量的方法[17],但目前也未见相关文献报道本品中两种苯胺类基因毒性杂质SM2、SM3的测定方法。因此建立超高效液相色谱-串联质谱(UHPLC-MS/MS)方法对瑞戈非尼中少量的苯胺类基因毒性杂质的含量进行控制。本研究依照ICH推荐的条件,建立了方法并从方法的专属性、溶液稳定性、线性与范围、定量限与检测限、准确度、精密度方面进行了方法学研究,本法灵敏、可靠、简便,为瑞戈非尼工艺过程控制和质量保障提供参考依据。

1 仪器与试剂

Agilent 1290-6470A LC-MS联用系统(美国安捷伦),配备电喷雾离子源(AJS ESI),质谱软件为Agilent MassHunter工作站;XS205DU百万分之一电子天平(瑞士梅特勒托利多公司)。Agilent RRHD C18(2.1 mm×100 mm,1.8 μm,填料:十八烷基硅烷键合硅胶;Agilent 公司)。

3-氟-4-氨基苯酚对照品(批号:P1156811,纯度:98%),3-三氟甲基-4-氯异氰酸苯酯对照品(杭州华东医药集团新药研究院有限公司,批号:191201,纯度:99.76%);瑞戈非尼(批号:RGFN-B-190901、Z193-A1911001,由A公司提供);甲醇(默克试剂有限公司)、异丙醇、甲酸(阿拉丁有限公司)均为色谱级。

2 方法与结果

2.1 色谱条件液相色谱柱:Agilent RRHD C18(2.1 mm× 100 mm,1.8 μm);流速 0.3 mL·min-1;0.05%甲酸水为流动相A,甲醇为流动相B,梯度洗脱(0～1.2 min,10%B;1.2～4.0 min,10%B→60%B;4.0～8.0 min,60%B;8.0～13.0 min,95%B;13.0～13.10 min,95%B→10%B;13.10～15.0 min,10%B);柱温35 ℃;进样体积5 μL。

取0.6 ng·mL-1混标对照品溶液,在MRM模式下进样分析,结果如图2所示,各杂质之间分离度良好。

2.2 质谱条件采用电喷雾离子源(AJS ESI),正负离子检测模式MRM采集(SM2正离子模式、SM3负离子模式),参数见表1。喷雾电压为3.5 kV,鞘气为250 ℃,鞘气流速为11 L·min-1,雾化气为45 psi,干燥气温度为300 ℃,干燥气流速为5 L·min-1。

表1 MRM采集参数设置

母离子及子离子:取0.6 μg·mL-1混标对照品溶液,在Scan模式下进样,进行MS分析,两种基因毒性杂质的质谱图如图4 所示,其中3-氟-4-氨基苯酚的母离子为m/z 128.05,3-三氟甲基-4-氯异氰酸苯酯的母离子为m/z 280.00。各基因毒性杂质的MRM参数见表1,定量离子及定性离子的选择见表1。

图4 定量限和检测限MRM质谱图

2.3 混标对照品溶液精密称取3-氟-4-氨基苯酚对照品、3-三氟甲基-4-氯异氰酸苯酯对照品各约6 mg,加稀释剂异丙醇溶解并稀释成 6 ng·mL-1的混标对照品储备液。精密量取适量,稀释10倍,作为0.6 ng·mL-1混标对照品溶液。

2.4 供试品溶液取本品约20 mg,精密称定,置20 mL容量瓶,用稀释剂溶解并稀释到刻度,摇匀;再精密量取0.1 mL,置10 mL容量瓶。异丙醇稀释至刻度,摇匀,作为供试品溶液(10 μg·mL-1)。

2.5 100%加标供试品溶液取本品约20 mg,精密称定,置20 mL量瓶中,用异丙醇溶解稀释至刻度,摇匀;再精密量取0.1 mL,置10 mL容量瓶,加入1 mL对照品储备液后,再用异丙醇稀释至刻度,摇匀,作为100%加标供试品溶液。

2.6 方法学考察

2.6.1 专属性试验取稀释剂照上述条件进行试验,记录色谱图,结果显示稀释剂不干扰测定,表明该方法专属性良好。

2.6.2 线性关系、检测限和定量限精密量取混标对照品储备液适量,加稀释剂稀释得到浓度分别为 0.15、0.3、0.45、0.6、0.9、1.2 ng·mL-1的混标对照品溶液,进样分析,绘制标准曲线,得线性方程(见表2)。逐步稀释,考察定量限及检测限(见图4)。

表2 瑞戈非尼中两种基因毒性杂质的线性范围、定量检测限及精密度

2.6.3 稳定性试验取 “2.3”项下 0.6 ng·mL-1的混标对照品溶液,“2.5”项下10 μg·mL-1的100%加标供试品溶液,连续进样16 h进行分析,各峰面积偏离度的绝对值在8 h内均小于17.22%,表明对照品溶液和100%加标供试品溶液在8 h内稳定性良好。

2.6.4 准确度和精密度试验精密称取瑞戈非尼(批号:RGFN-B-190901、Z193-A1911001)约20 mg,一式12份,分别置 20 mL 量瓶中,用异丙醇溶解稀释至刻度,摇匀;再精密量取0.1 mL,置10 mL容量瓶,精密加入“2.3”项下浓度为6 ng·mL-1的混标对照品储备液溶液0.25、0.5、1.0、1.5 mL,分别溶解并稀释至刻度,摇匀,即得低(0.15 ng·mL-1,3份)、中(0.30 ng·mL-1,3份)、高(0.60 ng·mL-1,3份)、极高(0.90 ng·mL-1,3份)4 个浓度的供试品加标溶液,取混标对照品溶液和各加标供试品溶液分别进样分析,外标法计算回收率结果见表3,各基因毒性杂质回收率均在90.64%～105.44%之间,RSD均小于3.50%,表明各基因毒性杂质回收率和精密度良好。

2.7 样品测定取瑞戈非尼供试品2 批(批号:RGFN-B-190901、Z193-A1911001),每批精密称取2份约 20 mg,置 20 mL 量瓶中,加稀释剂溶解并稀释至刻度,摇匀;再精密量取0.1 mL,置10 mL容量瓶,异丙醇稀释至刻度,摇匀,作为供试品溶液(10 μg·mL-1),进样分析,结果2批次瑞戈非尼中SM2均未检出,SM3均有检出(见表4)。

表4 瑞戈非尼中基因毒性杂质检测结果

3 讨论

3.1 瑞戈非尼的合成工艺如图1所示,以3-氟-4-氨基苯酚和N-甲基-4-氯-2-吡啶甲酰胺为原料、氢氧化钠为碱,THF 为溶剂,回流反应得到中间体4-(4-氨基-3-氟苯氧基)-N-甲基吡啶-2-甲酰胺,该中间体再与4-氯-3-三氟甲基苯胺以羰基连接得到瑞戈非尼无水物(4-[4-[[[4-氯-3-(三氟甲基)苯基]氨基甲酰]氨基]-3-氟苯氧基]-N-甲基吡啶-2-甲酰胺),加水而成。合成路线中涉及多个起始物料及中间体带有基因警示结构,因此,必须对瑞戈非尼合成路线中引入的带有基因警示结构的潜在基因毒性杂质进行控制。

3.2 控制限度参照瑞戈非尼片药品使用说明书,建议每日最低剂量为80 mg,每日最高剂量为160 mg。因为瑞戈非尼为抗肿瘤用药,可以不以ICH M7推荐的最严格的毒理学关注阈值(TTC,1.5 μg·d-1)为控制限制。本研究基于治疗期,以相对严格的1～10年治疗期的TTC(10 μg·d-1)为控制限制计算,瑞戈非尼中基因毒性杂质限度应为62.5×10-6,本研究以60×10-6作为瑞戈非尼中基因毒性杂质的控制限度。本次研究用样品中未检出SM2,检出的SM3 分别为13.6×10-6、41.4×10-6,均符合限度要求,但SM3检出量已超30%限度,值得关切。

3.3 色谱条件的优化色谱条件优化试验中,探索了甲醇、异丙醇和乙腈 3 种有机相(B相),水相(A相)中添加不同比率的酸(0.1%甲酸水,0.05%甲酸水和0.1%乙酸水)对分离度和灵敏度的影响。结果显示,采用 Agilent RRHD C18色谱柱,当流动相 0.05% 甲酸水溶液-甲醇梯度洗脱时,3-氟-4-氨基苯酚(SM2)、3-三氟甲基-4-氯异氰酸苯酯(SM3)响应较好,且两个化合物分离度良好,故流动相中选择0.05%甲酸水。本试验考察了流速0.2～0.4 mL·min-1范围内对苯胺类物质响应和峰形的影响,发现流速0.3 mL·min-1时,SM2,SM3离子化效率最高,出峰时间合适,且峰形较好。

3.4 质谱解析3-氟-4-氨基苯酚的质谱图中m/z 128.05为[M+H]+离子,主要的碎片离子有m/z 108 和 m/z 81.1,其中 m/z 108为去氟基产物,反映了3-氟-4-氨基苯酚的结构特征。试验对3-氟-4-氨基苯酚2个离子对 m/z 128.05→108 和 m/z 128.05→81.1的 MRM 参数见表1,其中,离子对m/z 128.05→108的信噪比较离子对 m/z 128.05→81.1更高,因此选择m/z 128.05→108作为定量离子对,m/z 128.05→81.1作为定性离子对。本法中SM3检测采用异丙醇衍生化,分析对象为SM3与异丙醇衍生后的产物。衍生产物精确分子量为281.04,其[M-H]-为280,反应过程见图5。

图5 SM3衍生化反应

SM3衍生产物,在质谱离子源中,子离子为酯键断裂后重排的m/z,碎裂途径见图6。

图6 SM3子离子裂解途径

本研究建立了超高效液相色谱-串联质谱法测定瑞戈非尼中的2种基因毒性杂质(3-氟-4-氨基苯酚(SM2)、3-三氟甲基-4-氯异氰酸苯酯(SM3),并进行了方法学验证,可以有效控制瑞戈非尼的潜在基因毒性杂质。该方法专属性强,灵敏度高,满足基因毒性杂质测定要求,可以作为瑞戈非尼原料药中基因毒性杂质的质控方法。