基于网络药理学和分子对接技术探讨玫瑰花黄酮治疗2型糖尿病的作用机制

王天煜,于慧,邢中夫,康璇,刘红燕,孙久兰,赵诗阳,赵盼

(1.山东中医药大学,山东 济南 250355;2.平阴县特色产业发展中心,山东 平阴 250400)

糖尿病(diabetes mellitus,DM)是一组由胰岛素绝对或相对分泌不足,胰腺或(和)胰岛素利用障碍所引起的代谢紊乱性疾病。主要分为1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus,T1DM)和2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)[1]。国际糖尿病联合会(International Diabetes Federation,IDF)数据显示,截至2021年,中国有1.7亿成年人患有糖尿病,占全球患病人数的31.7%,成为全球糖尿病患者最多的国家之一[2],预计到2035年,全球糖尿病患者将达到5.92亿[3]。

目前,临床上治疗糖尿病的药物以西药为主,如瑞格列奈、伏格列波糖、阿卡波糖等,但此类药物在长期服用过程中有着明显的副作用如:肾功能障碍、恶心、呕吐、腹痛、腹泻等[4]。近年来,从天然药用植物中寻找和开发能有效治疗糖尿病的药物已成为新的研究热点。

玫瑰为蔷薇科蔷薇属,多年灌木生植物,在我国各地均有种植,具有疏肝解郁、养血调经等功效[5]。现代研究表明玫瑰花中含有黄酮、挥发油、有机酸、多糖等多种化合物,其中黄酮类成分是主要活性成分之一,具有抗氧化、抗菌、降血糖、抗毒性、抗抑郁等作用[6]。周达等[7]通过体外小鼠实验证明了玫瑰花黄酮对四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠具有显著的降血糖作用。郭玉婷等[8]通过体外α-葡萄糖苷酶活性抑制实验证明玫瑰花对α-葡萄糖苷酶有较好的抑制作用。但其黄酮类成分降血糖作用机制仍不明确。

网络药理学是基于系统生物学的理论,可以从整体考察“药物-靶点-疾病”之间的复杂网络关系[9],对生物系统进行网络分析,选取特定信号节点进行多靶点药物分子设计的新学科,得到学界的广泛关注和应用。目前已有研究通过网络药理学方法,对玫瑰花与疾病之间的作用机制进行多通路的分析,如严宝飞等[10]利用网络药理学初步探讨了玫瑰花的潜在药理作用及其机理,但未阐述玫瑰花治疗糖尿病的具体机制。因此本研究在此基础上以玫瑰花黄酮为研究对象,采用网络药理学方法探究玫瑰花黄酮多途径、多层次、多靶点间复杂的相互作用关系,旨在从天然产物中寻找能够有效治疗2型糖尿病的成分,为天然药物治疗2型糖尿病提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 主要活性成分的建立课题组前期对玫瑰花黄酮进行提取纯化并进行质谱定性检测,通过对照品比对以及查阅文献方式建立了玫瑰花黄酮化合物库。登录中药系统药理学技术平台数据库(TCMSP,http://tcmspw.com/tcmsp.php)[11],设置类别为“Chemical name”,使用化合物英文名称作为关键词,收集整理活性成分的OB值和DL值,将整理出的化合物作为玫瑰花黄酮活性成分。将在PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中获得的相应化合物的SMILES name输入到SwissTargetPrediction(www.swisstargetprediction.ch)[12]网站中,选择物种为“Homo sapiens”,获取相应的基因靶点,建立最终的活性成分靶点数据库。

1.2 疾病靶点的筛选使用Disgenet数据库(https://www.disgenet.org)和GeneCards数据库[13](https://www.genecards.org/)以“diabetes mellitus type 2”为关键词筛选与2型糖尿病有关的疾病基因靶点。再将上述获得的化合物靶点与疾病靶点合并取交集,导入到Venny2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)中,建立疾病—化合物共同靶点数据库。

1.3 关键靶点的PPI网络构建为进一步了解玫瑰花黄酮成分治疗糖尿病靶点的相互作用,将整理得到的交集靶点导入到String(https://cn.string-db.org)中,设置物种种类为“Homo sapiens”构建ppi靶点互作网络关系图,将结果以tsv格式导出,导入到Cytoscape 3.9.0中,选择“Analyze Network”选项进行分析,最终以度(degree)值为依据,选择度值前十的靶点作为核心靶点。

1.4 交集靶点的GO分析和KEGG通路分析将疾病—化合物交集靶点导入DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/)[14]中进行GO生物过程富集分析以及KEGG信号通路分析,登录“微生信”网站(https://www.bioinformatics.com.cn)选择“富集气泡图”,将GO分析和KEGG分析的结果以图片形式进行展示。

1.5 活性成分与靶点分子对接首先借助Chem3D软件对之前筛选出的化合物进行能量最小化处理,在PDB数据库(https://www1.rcsb.org)搜索α-淀粉酶(α-amylase)的相关蛋白,选择5mey蛋白,下载其pdb格式保存,去除水分子和配体。再通过SYBYL-X软件将筛选出的玫瑰花黄酮化合物进行分子对接,得到相应的打分结果,最后运用Pymol 2.5.0将能量最低形态的化合物与蛋白对接结果进行可视化处理,以图片的形式导出并进行展示。

2 结果与分析

2.1 活性成分和作用预测靶点收集课题组根据对照品比对及文献查询,得到玫瑰花黄酮提取物成分解析,选择槲皮素、芹菜素、金丝桃苷、落新妇苷、山柰酚-3-O-葡萄糖苷、橙皮苷、木犀草素、山柰酚、柚皮素、鸡豆黄素A和樱黄素作为主要活性成分进行网络药理研究,并在TCMSP网站中收集它们的OB和DL值。分别将以上11种活性化合物名称输入到PubChem数据库中取得相应的SMILES name,再将SMILES name输入SwissTargetPrediction网站中,以“Homo sapiens”为调查的物种,获得各个化合物所对应的靶基因,建立化合物靶点库。

2.2 疾病和化合物靶点的筛选筛选出的11种活性化合物在SwissTargetPrediction网站中共获得772个靶点,去除重复项后得到246个靶点。在DisGeNET数据库和GeneCards数据库中以“diabetes mellitus type 2”为关键词,以打分值大于43为标准,去重后共检索出与2型糖尿病相关的基因靶点7 548个,使用Venny2.1.0对疾病靶点与活性成分靶点进行维恩图绘制,得到共同靶点207个,见图1,其中靶点包括NOX4、AVPR2、MMP13、PIK3R1等。

图1 玫瑰花活性成分靶点与糖尿病交集靶点

表1 玫瑰花黄酮活性成分及其参数

2.3 “药物成分—作用基因”网络图构建将“2.2”项下收集到的化合物成分与其对应的靶点基因信息录入到Cytoscape 3.9.0中生成“药物成分—作用基因”网络图,结果如图2所示。图中共有218个节点,667条边,节点之间的连线表明两者之间存在相互作用关系,连线越密集则两者关联度越高。其中,各化合物与编号之间的对应关系及各自匹配到的靶标数如表2所示。通过靶标数作为评价标准,可以分析得到槲皮素、芹菜素、橙皮苷、木犀草素、山柰酚、柚皮素的靶标数均较多,推测这些化合物可能在糖尿病的治疗或辅助治疗中发挥重要作用。

图2 玫瑰花“药物成分—作用基因”网络图

表2 化合物编号及靶标数

2.4 玫瑰花治疗糖尿病的作用靶点拓扑分析使用String数据库构建ppi靶点网络互作图,将“2.2”项下得到的疾病和化合物交集靶点导入String中,得到蛋白互作网络图(如图3所示),其中number of nodes=207、number of edges=2 144、average node degree=20.7、avg.local clustering coefficient=0.527、expected number of edges=851。将所得结果以TSV格式导出,使用Cytoscape 3.9.0软件进行拓扑分析,以“Analyze Network”选项中共有靶点的自由度、介数和中心性作为参考标准,结果发现AKT1(degree=111)、TNF(degree=100)、VEGFA(degree=92)等综合排名较高,具体情况如表3所示,表明这些靶点是玫瑰花黄酮成分治疗糖尿病的关键靶点。

图3 ppi蛋白网络互作图

表3 ppi核心靶点筛选结果

2.5 GO生物学功能富集分析为进一步探究玫瑰花黄酮治疗糖尿病的多重作用机制,将207个共同靶点导入DAVID中进行GO富集分析,共得到富集结果208条。选择前20条富集结果的生物过程(bp)、分子功能(mf)和细胞组成(cc)以气泡图的形式展示,如图4所示。其中,生物过程(BP)方面主要与蛋白质磷酸化、MAP激活酶与丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)的调控、蛋白酶信号传导的调节和细胞凋亡通路有关;分子功能(MF)方面主要与蛋白质丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性的调节、酶结合与ATP结合、相同蛋白结合和蛋白磷酸酶结合等过程有关;细胞组成(CC)方面则主要涉及质膜的组成、细胞外泌体、细胞质和胞外区等。

图4 GO功能富集分析图

2.6 KEGG通路分析

将207个共同靶点导入DAVID数据库进行KEGG通路分析,物种选择“Homo sapiens”,共得到分析结果186条。将富集结果较显著的前20条结果以富集气泡图的形式进行展示,如图5所示,图中圆圈的大小表示相关靶点在该通路富集的多少,越大代表通路越多;圆圈的深浅代表富集的程度,颜色越浅程度越高。其中癌症通路、脂质与动脉粥样硬化、糖尿病AGE-RAGE信号通路和PI3K-Akt信号通路富集程度较高,推测玫瑰花黄酮化合物主要是通过与这几条通路相互作用发挥治疗2型糖尿病的作用。

图5 KEGG富集结果气泡图

2.7 分子对接结果网络药理结果已经得出部分关键靶点玫瑰花治疗糖尿病方面所发挥的积极作用,于是为了进一步探究玫瑰花对人体内糖类分解酶的作用效果,选择α-淀粉酶的结晶复合物蛋白5mey与玫瑰花中活性成分进行分子对接。将对接结果以总打分值(Total Score)作为评价标准,选择打分排名前十的化合物为对接结果较好的化学成分,Total Score越高说明化合物分子与蛋白结合越稳定。筛选出的有效活性成分结果如表4所示。其中橙皮苷、落新妇苷、槲皮素等均与蛋白结合稳定,推测将会有不错的作用效果。将化合物与蛋白进行可视化展示,部分展示结果如图6所示。

图6 分子对接可视化结果

表4 活性成分与靶标蛋白分子对接得分

3 讨论

中药作为我国传统中医药理论体系指导下使用的天然药物,经过千百年来的人用经验已经证实其在糖尿病及其并发症的治疗方面有着良好的疗效和广阔的发展前景。而网络药理作为近年来新兴的分析学科,与玫瑰花这一传统中药相结合,能够从靶点通路角度为玫瑰花治疗糖尿病的机制提供新的研究思路[15]。因此本实验用网络药理学和分子对接技术探究玫瑰花治疗2型糖尿病的作用机理。

结果方面,槲皮素、山柰酚、木犀草素、橙皮苷和芹菜素在PPI网络构建中靶标数较多,说明这几种化合物是玫瑰花黄酮成分中对糖尿病起治疗作用的关键活性成分。其中,有相关研究证明槲皮素、山柰酚和木犀草素与AKT1、TNF、EGFR和VEGFA等靶点相关性较高,并且能通过癌症通路、AGE-RAGE通路和PI3K-AK通路等关键信号通路发挥治疗糖尿病的作用[16-18],是治疗糖尿病方面关键的活性成分。刘春颖等[19-20]通过实验证明了芹菜素可以通过竞争性抑制小鼠肠道中α-葡萄糖苷酶、蔗糖酶和麦芽糖酶的活性来发挥降血糖的药理作用。橙皮苷则是通过抑制细胞凋亡传导的途径、调控TNF相关靶点对糖尿病有一定的预防保护和改善作用[21]。

4 结论

综上所述,玫瑰花主要通过含有的槲皮素、木犀草素和山柰酚等黄酮成分来调控人体内AGE-RAGE、PI3K-Akt等信号通路,从而发挥治疗2型糖尿病的作用。研究结果为玫瑰花用于治疗2型糖尿病的作用机制提供了理论依据。