民族药四数九里香药效部位筛选及咔唑生物碱含量测定研究

周永福,姚如杰,黎学明,李应

(1.重庆紫光化工股份有限公司技术中心,重庆 401121;2.重庆大学化学化工学院,重庆 400044;3.重庆工业职业技术学院化学与制药工程学院,重庆 401120)

九里香属植物资源丰富,主要分布于我国的南部(海南、广东、广西、云南)和中南半岛。全球有14个种和2个变种,其中我国有9个种和1个变种[1]。九里香属植物药用记载始于《岭南采药录》。现代药理研究表明:九里香属植物药具有增强机体免疫力[2]、抗菌消炎和麻醉[3]、降血糖[4]、行气止痛、活血化瘀之功效[5]。民间用于治疗胃痛、风湿痹痛、牙痛、跌扑肿痛、虫蛇咬伤[6-7];现代药物化学研究表明,其主要含有咔唑生物碱、黄酮类、香豆素类等[8-9]化学成分。

四数九里香(MurrayatetrameraHuang)作为九里香属植物的一种,主要分布于我国的广东、海南、广西、云南。在云南少数民族地区(彝族、黎族、苗族、回族、壮族、傣族)以其干燥叶入药。调研发现,有将四数九里香干燥叶的醇提物和精油制成注射剂,用于治疗肺癌的例子。另外,四数九里香富含咔唑生物碱类化合物[10],文献[11-12]报道咔唑生物碱化合物具有抑制肿瘤细胞增殖的作用。然而,有效成分不明,药效部位、药效物质不清是民族药四数九里香存在的问题,这严重影响了其质量标准的建立,为此,本文以95%乙醇为提取剂,采用冷浸渍法对四数九里香叶进行浸提、制得浸膏,再按溶剂极性大小依次对浸膏进行萃取、得萃取部位,利用传统柱层析硅胶法对药效部位进行分离和纯化,制得单体化合物;以5株肿瘤细胞为模型,研究了四数九里香萃取液和7种咔唑生物碱成分对肿瘤细胞的体外生长抑制作用,并采用标准曲线法分析测定了四数九里香中咔唑类生物碱的含量,以期为四数九里香质量标准的建立提供参考。

1 仪器及材料

1.1 仪器二氧化碳培养箱(济南鑫贝西生物技术有限公司)、多功能酶标分析仪(Multiskan FC)、电子天平(ME204上海巴玖实业有限公司)、高效液相色谱仪LC-16(岛津仪器苏州有限公司),色谱柱:Dimension(4.6 mm×250 mm,5 μm),流动相:乙腈-水溶液(55∶45),检测波长:415 nm,流速:1.0 mL·min-1,柱温:30 ℃,光电二极管阵列紫外可见光检测器(SPD-M20A 230V),液相色谱仪溶液传输单元(LC-16)、脱气机(DGU-20A3R)、自动进样器(SIL-16)。

1.2 试剂95%乙醇,蒸馏水,邻苯二甲酸氢钾(AR),氢氧化钠(AR);乙酸乙酯(分析纯)、石油醚(分析纯)、二氯甲烷(分析纯)、甲醇(分析纯)。

1.3 样品四数九里香药材经成都中医药大学陈新教授鉴定为芸香科九里香属四数九里香(MurrayatetrameraHuang)的叶,标本(标本编号:20160122001)存于重庆工业职业技术学院中医药物研究所;四数九里香叶粉末、质量标准控制物mahanimbine(自制)、5株肿瘤细胞购自中国科学院昆明植物所细胞库。

2 方法与结果

2.1 实验方法

2.1.1 提取、分离及鉴定方法四数九里香叶35 kg,自然晾干,粉碎,用95%的乙醇溶液提取,过滤、合并、浓缩、得黑色浸膏2.8 kg,温水溶解,分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取,得石油醚萃取部分200 g、乙酸乙酯萃取部分680 g、正丁醇萃取部分460 g。课题组前期已经报道[13]化合物1-甲基-3-丙酰基咔唑(1)、1-甲氧基-3-乙基咔唑(2)、1-甲氧基-3-甲酰基咔唑(3)、1-甲氧基-3-甲基咔唑(4)、1-羧基甲酯-3-甲基咔唑(5)、1-羧基甲酯-3-乙基咔唑(6)、mahanimbine(7)的结构鉴定及对肝癌肿瘤细胞SMMC-7721的毒活性,本论文研究和报道其对其他4株肿瘤细胞的毒活性,结构图见图1。

图1 化合物1～7结构

2.1.2 细胞毒活性实验方法把培养液DMEM(含10%胎牛血清)配成单个细胞悬液,以每孔3 000～15 000个细胞接种到96孔板,每孔体积100 μL,细胞提前12～24 h接种培养。供试样用DMSO溶解,单体化合物以40 μmol·L-1浓度初筛,粗提物以100 μg·mL-1浓度进行初筛,根据下列公式计算抑制率(%);精准称取乙酸乙酯萃取段100 mg、用DMSO溶剂溶解,定容为200 μL,以100.00、20.00、4.00、0.80、0.16 μg·mL-1浓度梯度;精密称取各化合物1.0～3.0 mg,用DMSO溶解,以40.000、8.000、1.600、0.320、0.064 μmol·L-1浓度梯度,计算各浓度点的细胞存活率,以浓度为横坐标,细胞存活率为纵坐标,绘制细胞生长曲线,应用两点法(reed and muench法)计算化合物的IC50值[14],实验均设顺铂(DDP)和紫杉醇(Taxol)两个阳性对照化合物。

细胞抑制率(%)=(A对照-A样品)/(A对照-A空白)×100%

式中,A空白为含有MTS溶液、培养液、细胞的吸光度;A对照为含有MTS溶液、培养液、细胞、阳性化合物的吸光度;A样品为具有MTS溶液、培养液、细胞和药物的吸光度。

2.1.3 统计学方法采用软件对所有数据进行统计学处理,使用单因素方差分析组间均数差异性,P<0.05或P<0.01为差异具有统计学意义。

2.1.4 溶液制备方法[15]称取实验室自制咔唑生物碱mahanimbine(纯度98.9%)6.1 mg,置于50 mL烧杯中,加丙酮溶解、转移至50 mL容量瓶中、甲醇定容得0.122 mg·mL-1对照品溶液;精密称取四数九里香叶粗粉0.950 1 g,于100 mL的磨口锥形瓶中,丙酮定容、超声波提取1 h、冷却、过滤、备用。

2.1.5 色谱条件色谱柱:Dimension(4.6 mm×250 mm,5 μm),流动相:乙腈-磷酸二氢钾溶液(51 mmol·L-1)配比:55∶45,检测波长:415 nm,流速:1.0 mL·min-1,柱温:30 ℃,光电二极管阵列紫外可见光检测器(SPD-M20A 230V),相色谱仪溶液传输单元(LC-16)、脱气机(DGU-20A3R)、自动进样器(SIL-16)。

2.2 实验结果

2.2.1 各萃取馏分细胞毒活性结果分别精准称取粗提样,石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取部位,水相部位各2.0～3.0 mg于复孔中,DMSO溶解,定容为200 μL,按照“2.1.2”项下方法,研究各部位对5株肿瘤细胞体外抑制作用,结果见表1。

表1 各提取液对5株肿瘤细胞体外抑制作用结果(细胞抑制率,%)

经过实验,发现以100 μg·mL-1浓度点初筛时,四数九里香醇提液的乙酸乙酯萃取部位对5株肿瘤细胞的抑制率(%)最大,故确定乙酸乙酯萃取部位为有效部位。精准称取乙酸乙酯萃取部位100 mg、用DMSO溶剂溶解,定容为200 μL,以100.00、20.00、4.00、0.80、0.16 μg·mL-1为浓度梯度,根据“2.1.2”项下方法计算IC50值,结果见表2。

表2 乙酸乙酯萃取段细胞毒活性IC50研究结果(IC50±SD,μg·mL-1)

2.2.2 化合物1～7细胞毒活性结果精准称取化合物1～7各2.0～3.0 mg于复孔中,采用DMSO溶剂溶解,定容为200 μL,在40 μmol·L-1浓度下,按照“2.1.2”项下实验方法分析化合物1～7对4株肿瘤细胞(白血病HL-60、肺腺癌A-549、乳腺癌MCF-7、结肠癌SW-480)的抑制率(%);设顺铂(DDP)和紫杉醇(Taxol)两个阳性化合物,结果见表3。

表3 化合物1～7的肿瘤细胞毒活性测试结果(细胞抑制率,%)

经过实验,发现7个化合物表现出抑制作用,其中对于白血病细胞HL-60,各化合物的抑制率为化合物7>化合物1>化合物6>化合物4>化合物3>化合物2>化合物5,即化合物7的抑制率最大;对于肺癌细胞A-549,各化合物的抑制率为化合物7>化合物3>化合物1>化合物4>化合物5>化合物6>化合物2,即化合物7的抑制率最大;对于乳腺癌细胞MCF-7,各化合物的抑制率为化合物4>化合物7>化合物6>化合物5>化合物2>化合物1>化合物3,即化合物4的抑制率最大;对于结肠癌细胞SW-480,各化合物的抑制率为化合物5>化合物7>化合物6>化合物4>化合物1>化合物3>化合物2,即化合物5的抑制率最大。

在此基础之上,精密称取各化合物1.0～3.0 mg,用DMSO溶解,以40.000、8.000、1.600、0.320、0.064 μmol·L-1为梯度浓度坐标,按照“2.1.2”项下方法进行复筛,各化合物的IC50(μmol·L-1),结果见表4。

表4 化合物1～7的细胞毒活性测试结果(IC50±SD,μmol·L-1)

在化学成分的分离及鉴定实验研究中,发现化合物7(mahanimbine)的量大,同时对4株肿瘤细胞的毒活性表现出良好抑制作用。故选其作为质量控制标准物,分析其在民族药四数九里香中的含量,尝试建立测定方法,以期为民族药四数九里香质量标准建立提供方法。

2.2.3 精密度试验结果取mahanimbine对照品溶液,进样量为2.0 μL,连续进样6次,记录峰面积值,考察在拟定条件下仪器的精密度,结果见表5。

表5 精密度试验结果

经过试验,RSD=1.9%,小于3.0%,表明仪器精密度良好。

2.2.4 标准曲线绘制取咔唑生物碱mahanimbine对照品溶液1.0、3.0、5.0、7.0、9.0、11.0 μL,依次进样,测定峰面积,结果见表6;以进样量X(μL)为横坐标,峰面积为纵坐标,进行线性回归,得数学模型Y=879 307X-389 981(R2= 0.999 2)。

表6 标准曲线测定结果

研究表明,对照品咔唑生物碱mahanimbine溶液在0.11～1.45 μg之间线性关系良好。

2.2.5 稳定性考察在色谱条件下,自动取1 μL供试品溶液进样,每隔2 h进样一次,记录峰面积,结果见表7。

表7 稳定性试验结果

经过试验,样品在保存至8 h,RSD=1.28%,小于3.00%,符合稳定性试验的要求。

2.2.6 重复性考察取四数九里香粗粉,超声提取,进样量为1.0 μL,平行制备5份样,在色谱条件下,依次进样,记录峰面积并计算含量,结果见表8。

表8 重复性试验结果

重复性试验RSD为1.98%,小于3.0%,试验结果表明仪器重复性良好,符合重复性试验规定。

2.2.7 加样回收率试验精密称取四数九里香叶粗粉约0.1 g,共9份,分成3组,分别精密加入对照品溶液1.0、3.0、5.0 mL,每个浓度对应一个组,按提取和色谱条件进行提取和测定,记录峰面积值,考察加样回收率,结果见表9。

表9 加样回收率试验结果

试验平均回收率值为101.33%,在95%～105%之间,RSD为1.77%,结果表明,符合加样回收率试验规定。

2.2.8 Mahanimbine的含量测定按照“2.1.4”项下操作方法,提取四数九里香叶待测液,连续自动进样3次,每一次进样量为2.0 μL,按上述拟定的色谱条件进行测定,记录峰面积,将峰面积带入标准曲线,计算含量,结果见表10。

表10 四数九里香中mahanimbine含量测定结果

把试验结果代入标准曲线方程,分析测定,得民族药四数九里香中mahanimbine的含量为61.08 μg·g-1。

3 结论与讨论

本论文围绕前期的调研,从民族药四数九里香的药效部位筛选、药效物质基础的揭示、质量控制标准物的筛选及含量测定三个方面来研究民族药四数九里香。目前,《中国药典》2020年版收录九里香属植物的两个种,即九里香[Murrayapanaculata(L.)Jack]和小叶九里香[Murrayapaniculata(L.)var.exotica(L.)Huang];而四数九里香作为民族药収载于地标《云南省中药材标准》(2005年版)(第一册·彝族药)中,由于四数九里香抑制肿瘤细胞增殖作用药效物质基础的相关研究较少,从而制约了四数九里香质量控制标准体系建立,为此,本实验以95%乙醇为提取溶剂、采用浸渍法对四数九里香进行提取、浓缩、制得粗提物,采用不同极性溶剂对粗提物进行萃取,得萃取部位,研究了各萃取部位对5株肿瘤细胞体外抑制作用。研究表明,各萃取部位对5株肿瘤细胞都具有抑制作用,但经比较,在几个萃取部位中,乙酸乙酯萃取部位对5株肿瘤细胞的抑制(率)作用最大,从而确定醇提物的乙酸乙酯萃取部位为民族药四数九里香的有效部位。

近些年,因咔唑生物碱具有抗炎、抗氧化和抗癌等药理作用[16-17],故含有咔唑类生物碱的植物和咔唑类生物碱的合成成为研究的热点。本研究从民族药四数九里香的药效部位即乙酸乙酯萃取部位分离、鉴定7个咔唑生物碱,并研究了这7个咔唑生物碱对4株肿瘤细胞的抑制增殖活性。结果表明,7个咔唑生物碱化合物对4株肿瘤细胞显示出良好的抑制作用,此结果进一步揭示民族药四数九里香抑制肿瘤细胞增殖作用的药效物质基础。

目前,关于民族药四数九里香质量标准物是哪一个化合物还未确定。本研究在揭示民族药四数九里香抑制肿瘤细胞增殖作用的药效物质基础之后,我们以自制的咔唑生物碱mahanimbine为质量控制标准物,采用高效液相色谱法,进一步分析咔唑生物碱mahanimbine在民族药四数九里香中的含量,并尝试建立快速分析四数九里香中咔唑生物碱mahanimbine的测定分析方法。本法操作简便,结果可靠,重现性好,为四数九里香的质量标准研究提供了实验依据。