固本明目颗粒对D-半乳糖性白内障模型大鼠抗氧化作用的研究

张娟,魏霞,王海苹,李水仙,耿雪,赵岩,祝清芬

(1.山东省食品药品检验研究院,国家药品监督管理局仿制药研究与评价重点实验室,山东 济南 250101;2.金诃藏药<山东>健康产业有限公司,山东 济南 250101)

白内障是由增龄、免疫和代谢异常、局部营养障碍、创伤等多种原因引起的晶状体代谢紊乱,使晶状体蛋白发生变性,最终导致晶状体混浊[1]。白内障是导致老年人视力障碍的主要原因之一,位居我国致盲性眼病首位[2]。目前该病治疗方法主要为单纯型白内障手术、分阶段手术、超声乳化术以及联合治疗等,虽然可取得短期治疗效果但长期来看手术治疗后患者视网膜脱离的累积风险逐年增加,因此白内障特效药物研发对该疾病的预防及治疗至关重要[3-5]。糖性白内障发病的主要机制是血糖浓度升高,导致晶体内葡萄糖含量增加,促使晶状体蛋白糖化,并进一步导致其结构和功能出现异常,使得晶状体混浊,最终导致白内障的发生[6]。固本明目颗粒制备生产工艺发生改变,固本明目颗粒2(制备工艺改变)不喷入乙醇溶解的冰片、熊胆粉和丁香等挥发油,其他均与固本明目颗粒1(目前市售制剂)制备工艺一致,本研究通过D-半乳糖建立大鼠的糖性白内障模型,研究固本明目颗粒改变工艺前后对糖性白内障有无预防作用及预防作用是否存在差异。

1 材料

1.1 药品与试剂固本明目颗粒1(国内某公司,目前市售制剂,规格:每袋装5 g;批号:01170502-1);固本明目颗粒2(国内某公司,制备工艺改变,规格:每袋装5 g;批号:01170502-2);吡诺克辛钠滴眼液(湖北远大天天明制药有限公司,批号:170734);复方托吡卡胺滴眼液(扩瞳剂)(沈阳兴齐眼药股份有限公司,批号:170302);D-半乳糖(国药集团化学试剂有限公司,规格:100 g;批号:20161124);总超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)测定试剂盒、谷胱甘肽-S转移酶(GST)试剂盒、谷胱甘肽(GSH)试剂盒、Na+-K+-ATP酶试剂盒(南京建成生物工程研究所);BCA蛋白测定试剂盒(碧云天生物技术有限公司,产品编号:P0010S,200次,P0010S)。

1.2 主要仪器设备Spectramax190酶标仪(美谷分子);紫外分光光度计(日本岛津公司);BS323S电子天平(Sartorius公司);YP1002N电子天平(上海精密科学仪器有限公司);恒温水浴锅(常州国华电器有限公司);ZH-2型自动漩涡混合器(天津药典标准仪器厂);3-18K台式冷冻离心机(Sigma公司);YZ5T裂隙灯显微镜(苏州六六视觉)。

1.3 实验动物SD大鼠,SPF级,20日龄,45.15～56.84 g,雄性90只,购自济南朋悦实验动物繁育有限公司[生产许可证号SCXK(鲁)2014 0007];饲养于山东省食品药品检验研究院屏障环境动物实验室[使用许可证号为SYXK(鲁)2013 0012]。

饲养条件:温度:20～26.0 ℃,相对湿度:40%～70%,日温差≤3 ℃,照明时间:12 h明暗交替,换气次数:≥15次每小时。大、小鼠繁殖饲料(北京科澳协力饲料有限公司),饲料生产许可证号:京饲证(2014)06054;实验动物(饲料)生产许可证号:SCXK(京)2014-0010。

2 方法[7]

2.1 剂量设计及依据试验时以人体推荐剂量的10倍作为固本明目颗粒1和固本明目颗粒2中剂量组(根据药理实验设计中动物剂量换算[8],前期急性毒性及预试验的结果设定)。本品用法用量为:一次5 g,一天2～3次。成人体重按60 kg计算,相当于每日最大用量为0.25 g·kg-1。人体推荐量的10倍可作为中剂量,即2.5 g·kg-1,低剂量和高剂量分别设计为1.25 g·kg-1和5 g·kg-1。

2.2 分组与给药取20日龄雄性大鼠90只,随机分为9组,分为空白对照组、模型对照组、吡诺克辛钠滴眼液阳性对照组、固本明目颗粒1和2 均设 1.25、2.5、5 g·kg-13个剂量组,每组10只。分组后固本明目颗粒1和2 各组灌胃给予相应剂量的药物溶液10 mL·kg-1,每天1次,连续21 d。空白对照组、模型对照组给予同体积的纯化水,阳性对照组给予吡诺克辛钠滴眼液,每天2次,每次1～2滴。同时大鼠22日龄起模型对照组、阳性对照组、固本明目颗粒1和固本明目颗粒2各剂量组喂养D-半乳糖溶液,1～7 d喂养12.5%D-半乳糖溶液, 8～19 d喂养10%D-半乳糖溶液;每周称量2次体重。

2.3 指标检测分别在造模第3、11、14、19天,用复方托吡卡胺滴眼液散瞳,裂隙灯显微镜下观察、拍照并记录晶状体浑浊度,根据糖性白内障分级标准进行评分。造模第19天末次药后处死动物,后囊法取出晶状体,生理盐水漂洗后,滤纸吸干表面水分,分别称重后放入试管中,加入提前预冷的磷酸盐缓冲液,在冰水浴的条件下,匀浆并制成20%组织匀浆液。4 ℃,2 000 r·min-1,10 min条件下离心,取上清液按照试剂盒中说明书操作,测定SOD、GSH、GST、GSH-Px、Na+-K+-ATP酶抗氧化指标。试验结束时,每组2只大鼠取出眼球经Davidson′s氏液固定,固定24 h后移至10%中性福尔马林液固定,石蜡包埋后切片,HE染色镜检并报告。

糖性白内障分级标准[9]如下:

0级:晶状体完全透明、无任何混浊;1级(囊泡初期):晶状体周边出现细小囊泡或者囊泡群;2级(囊泡期):细小囊泡、中等囊泡逐渐由赤道部向前极皮质扩展,形成环状带,环带逐渐增宽至晶状体直径的1/3～2/3,伴有或者不伴有“Y”扩张;3级(皮质期):皮质呈现不规则的条纹状或剑竹状向前极放射的絮状混浊灶,并逐渐形成弥漫性灰色至灰白色的絮状混浊,晶状体核尚透明;4级(核混浊期):晶状体除皮质絮状混浊外,核密度也逐渐增高,颜色由灰色向灰白、白色发展,伴有或不伴有水泡和“Y”扩张;5级(成熟期):晶状体皮质开始进一步由絮状混浊向致密白色混浊发展,最终与核融为一体呈白色球状物。

2.4 使用统计学方法SPSS软件16.0单因素方差分析,各组之间比较采用LSD或者Dunnetts T3进行分析。

3 结果

3.1 固本明目颗粒对D-半乳糖性白内障晶状体浑浊程度的影响结果见表1和图1,空白对照组大鼠晶状体均完全透明、无任何混浊。固本明目颗粒1各剂量组和固本明目颗粒2各剂量组大鼠晶状体在5级(成熟期)的眼数明显比模型对照组少。

图1 试验结束时各剂量组晶状体观察结果

表1 试验结束时各组晶状体浑浊眼数分布(左右眼)

3.2 固本明目颗粒对D-半乳糖性白内障抗氧化指标的影响结果见表2,与空白对照组比较,模型对照组大鼠晶状体中GSH和SOD含量明显降低(P<0.01);与模型对照组比较,固本明目颗粒1低剂量组GSH、中剂量组SOD、高剂量组GST明显升高(P<0.05);固本明目颗粒2中、高剂量组GSH、中剂量组SOD明显升高(P<0.05和P<0.01);其他指标未见统计学差异。

表2 固本明目颗粒对D-半乳糖性白内障晶状体抗氧化指标的影响

3.3 组织病理学检查结果结果见图2,空白对照组、阳性对照组以及固本明目颗粒1和颗粒2各剂量组动物角膜、视网膜结构完整、层次分明,均未见明显组织病理学改变。模型对照组出现晶状体萎缩,晶状体囊与虹膜粘连,晶状体变性,晶状体纤维排列不规则、分界不清,局灶性晶状体纤维肥大,晶状体纤维液化等。本实验室条件下,阳性对照组、固本明目颗粒1和颗粒2组与模型对照组比较,均未见明显改善。

图2 试验结束时各剂量组晶状体组织的病理学改变

4 讨论

外伤、营养障碍等均可引起晶状体代谢紊乱,从而导致白内障的产生。其对于视力危害极大,严重影响日常生活[10]。D-半乳糖介导的啮齿动物衰老模型已广泛应用于衰老相关性疾病及抗衰老研究[1]。本研究采用20日龄大鼠给予D-半乳糖造模,建立了成熟的糖性白内障模型,从而进行研究固本明目颗粒对糖性白内障损伤的保护作用,比较固本明目颗粒工艺改变前后的作用差别。试验结果表明,试验建立的糖性白内障模型,在较短的时间(19 d)内,大鼠能够发生典型的白内障,100%的大鼠晶状体浑浊度达到3级以上,80%晶状体浑浊度达到4级以上,70%晶状体浑浊度达到5级。而且发生的阶段容易控制,有利于进行研究药物对白内障损伤的保护效果。

据文献报道[11],在糖尿病性或者糖性白内障模型中,晶状体的首发改变是在赤道部发生球状变性和混浊。采用照相法对造模第3、11、14、19天大鼠晶状体浑浊程度进行记录并评分,结果发现晶状体的最开始的改变是从赤道部发生空泡、球状变性和浑浊。因此,除了检测生化指标的改变,用照相法记录大鼠的晶状体形态改变,是非常重要的[12]。本研究结果显示,固本明目颗粒1和固本明目颗粒2均能明显缓解大鼠晶状体浑浊,且固本明目颗粒工艺改变前后未见明显差异。

晶状体渗透性膨胀的同时伴随着氧化还原状态的失衡[13]。选择测定谷胱甘肽生化指标,因为其在晶状体中含量高,容易检测[12]。晶状体中谷胱甘肽浓度降低,是已知的不可逆转的白内障发生首先出现的生化异常,而且是特征性的[14]。除了谷胱甘肽(GSH),选择了总超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、谷胱甘肽-S转移酶(GST)、Na+-K+-ATP酶的生化指标,结果表明,固本明目颗粒1能够明显促进GSH、SOD、GST浓度的升高;固本明目颗粒2能够明显促进 GSH、SOD浓度的升高,固本明目颗粒1和固本明目颗粒2未见相关抗氧化指标有明显差异,提示其发挥治疗D-半乳糖性白内障药效可能与保护细胞免受氧化损伤相关。

综上所述,提示固本明目颗粒1和固本明目颗粒2对D-半乳糖性白内障有一定的抗氧化作用。研究结果未发现固本明目颗粒制备工艺改变前后有明显变化,本研究为固本明目颗粒的生产工艺提供了参考依据。