MEBT/MEBO对大鼠慢性难愈合创面组织中MMP-2、CXCL1、GM-CSF蛋白表达的影响

赵 权,谢嘉敏,唐乾利,甘苡榕,左远娟,王雪玲,黄金梅

(1. 广西中医药大学研究生院,广西 南宁 530001;2. 防城港市中医医院,广西 防城港 538021)

慢性难愈合创面多发生于糖尿病、创伤、血管硬化、静脉曲张、营养不良、神经病变、截瘫、长期卧床等患者,其发生机制复杂,与各种细胞因子的表达密切相关[1]。粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)是一种能调控粒细胞、巨噬细胞增殖、分化及功能的细胞因子,难愈合性创面的形成与GM-CSF缺乏相关[2];基质金属蛋白酶2(MMP-2)具有降解细胞外基质并激活细胞因子、趋化因子的功能,参与皮肤伤口愈合如炎症、基质重塑和上皮的形成[3];趋化因子(CXC)是伤口愈合的关键参与者,其中趋化因子配体1(CXCL1)功能受损可能导致创面愈合延迟[4]。目前,湿润暴露疗法/湿润烧伤膏 (MEBT/MEBO)已被应用于各种慢性创面中,且疗效显著[5-6]。但其修复慢性难愈合创面的机制尚未完全明确,故本研究构建慢性难愈合创面大鼠模型,探讨MEBT/MEBO对大鼠慢性难愈合创面组织中MMP-2及CXCL1、GM-CSF蛋白表达的影响。

1 实验材料与方法

1.1动物 清洁级健康SD大鼠72只,体重200～250 g,由广西食品药品检验所实验动物中心提供,动物合格证号:SCXX (桂) 2003-0001。所有动物饲养在广西中医药大学第一附属医院实验动物房内,饲养温度为21～24 ℃,相对湿度 45%～55%,昼夜循环,保持12 h光照,自由进食进水,隔日更换垫料。

1.2药品及试剂 MEBO(商品名:美宝,汕头市美宝制药有限公司,国药准字Z20000004);重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶(商品名:贝复新,珠海亿胜生物制药有限公司,货号:04481212);醋酸氢化可的松(上海源叶生物科技有限公司,货号:S47632);Masson试剂(北京索莱宝科技有限公司);Rat matrix metalloproteinase9(MMP-9) ELISA KIT。

1.3仪器 5410型低温高速离心机、微量移液器(德国Eppendorf公司);Multiskan FC型酶标仪(美国Thermo Fisher Scientific公司);IX71型倒置荧光显微镜(日本Olympus公司);漩涡混合器(江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司)。

1.4实验方法 将72只SD大鼠随机分为急性皮损组、慢性创面组、贝复新组、美宝组,每组18只。采用5%水合氯醛10 mg/kg腹腔注射麻醉各组大鼠,先用电动刹刀剃去背部毛发,再用Nair脱毛膏进一步脱毛。脱毛后用清水洗涤后擦干背部皮肤,将大鼠置于28～30 ℃环境中,自然复苏后,自由饮食24 h以上,消除脱毛剂对皮肤的损伤作用。脱毛24 h后,以相同的方法再次将大鼠麻醉,用直径15 mm的图章标记造模面积,在无菌条件下,沿脊椎方向用外科方法做2个深达筋膜、直径为15 mm的全层皮肤缺损开放性创面,然后加盖2层消毒干纱布,用胶布“丰”形固定。急性皮损组大鼠用生理盐水清洗创面后,放入装有玉米芯垫料的单个笼子中,予足够的水和饲料。其余组大鼠造模后即刻一次性腹腔注射醋酸氢化可的松(8 mg/100 g体重,注射量约为3 mL/只)建成慢性难愈合创面,注射完成后用生理盐水清理创面,贝复新组创面敷上贝复新凝胶,美宝组创面敷上美宝烧伤膏,均每日上下午各换药1次。

1.5检测指标及方法 各组于伤后第3,7,14天分别随机取6只大鼠,麻醉后从深筋膜下层切取距离创缘0.5 cm的整个创面,放入10%的中性福尔马林中固定。

1.5.1创面组织中胶原纤维生成情况 取创面组织标本,进行脱水、包埋、切片(厚度4～6 μm),Masson染色处理,在光学显微镜下观察组织中胶原纤维生成情况,采用Image Pro Plus 6.0软件测量各组皮肤组织中胶原纤维的含量。

1.5.2创面组织中MMP-2含量 采用ELISA法检测创面肉芽组织中MMP-2含量,严格按试剂盒说明书操作。

1.5.3创面组织中CXCL1、GM-CSF表达情况 将创面组织切片进行脱蜡后,置于ETDA缓冲液中进行微波炉抗原修复,过氧化氢浸泡10 min,山羊血清封闭30 min后,一抗4 ℃(按1∶100比例)孵育过夜,次日复温后PBS洗3次,二抗37 ℃恒温箱孵育30 min,DAB染色后流水冲洗5 min;经苏木素复染,盐酸酒精快速分化,75%,85%,95%,100%酒精依次脱水后,中性树胶封片。显微镜下观察CXCL1、GM-CSF阳性表达情况,采用Image Pro Plus 6.0软件测量各组目的蛋白平均光密度。

2 结 果

2.1各组大鼠创面愈合情况 急性皮损组大鼠创面渗血、渗液少,肉芽组织生长旺盛,创面愈合速度较快;慢性创面组大鼠创面渗血、渗液较多,每日换药需清理较多分泌物,肉芽组织生长缓慢,甚至有脓液形成,愈合速度最慢;贝复新组和美宝组大鼠创面渗血、渗液较少,水肿消退较快,肉芽组织生长旺盛,创面愈合速度较快。见图1。

图1 急性皮损组和慢性难愈合创面各组大鼠伤后不同时间点创面组织愈合情况

2.2各组大鼠创面组织Masson染色表现 各组创面组织中胶原纤维含量随伤后时间的延长逐渐增加。急性皮损组和慢性创面组各时间点创面组织中胶原纤维含量比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。伤后第3天,贝复新组和美宝组胶原纤维含量均明显高于慢性创面组(P均<0.05),且美宝组明显高于贝复新组(P<0.05);伤后第7天,美宝组胶原纤维含量均明显高于慢性创面组和贝复新组(P均<0.05);伤后第14天,各组间胶原纤维含量比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见图2及表1。

表1 急性皮损组和慢性难愈合创面各组大鼠伤后不同时间点创面组织中胶原纤维表达量比较

图2 急性皮损组和慢性难愈合创面各组大鼠伤后不同时间点创面组织Masson染色表现(×200)

2.3各组大鼠创面组织中MMP-2含量 随伤后时间的延长,急性皮损组与慢性创面组创面中MMP-2含量均呈先升高后降低的趋势,但组间比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。随伤后时间的延长,贝复新组创面组织中MMP-2含量增加(P<0.05),美宝组创面组织中MMP-2含量减少(P<0.05)。伤后第3天,美宝组创面组织中MMP-2含量明显高于慢性创面组(P均<0.05);伤后第7天,贝复新组和美宝组创面组织中MMP-2含量较模型组有下降但差异无统计学意义(P均>0.05);伤后第14天,美宝组创面组织中MMP-2含量明显低于慢性创面组和贝复新组(P均<0.05),贝复新组创面组织中MMP-2含量明显高于慢性创面组(P<0.05)。见表2。

在进行农产品质量安全保障体系构建过程中，需要实施从产品生产到产品销售全过程监督管理模式。主要是因为，现阶段国内农业生产仍然以一家一户格局为主，农户是农产品主要提供者与生产者。由于利益驱使，个别农户为降低产品生产成本，很容易会选择价格低廉农药或者非法添加各种激素等，会使产品质量安全大打折扣，是影响农产品质量的源头，而产品包装、运输以及储存等环节如果出现问题，会造成产品二次污染，所以实施全过程质量监督与管理极为重要。

表2 急性皮损组和慢性难愈合创面各组大鼠伤后不同时间点创面组织中MMP-2含量比较

2.4各组大鼠创面组织中CXCL1表达情况 急性皮损组与慢性创面组各时间点创面组织中CXCL1表达平均光密度比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。急性皮损组伤后第7,14天创面组织中CXCL1表达平均光密度均明显高于伤后第3天(P均<0.05),但伤后第14天明显低于伤后第7天(P<0.05);慢性创面组伤后第7,14天创面组织中CXCL1表达平均光密度高于伤后第3天,但差异均无统计学意义(P均>0.05),伤后第7,14天CXCL1表达平均光密度相近(P均>0.05);贝复新组伤后第7天创面组织中CXCL1表达平均光密度较伤后第3天低但差异无统计学意义(P>0.05),伤后第14天明显低于伤后第3天(P<0.05);美宝组伤后第3,7,14天创面组织中CXCL1表达平均光密度比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。伤后第3天,贝复新组和美宝组创面组织中CXCL1表达平均光密度均较慢性创面组有升高趋势但差异无统计学意义(P均>0.05);伤后第7天和第14天,慢性创面组、贝复新组、美宝组创面组织中CXCL1表达平均光密度比较差异均无统计学意义(P均>0.05),但贝复新组创面组织中CXCL1表达平均光密度较美宝组、慢性创面组有降低趋势。见图3及表3。

表3 急性皮损组和慢性难愈合创面各组大鼠伤后不同时间点创面组织中CXCL1表达平均光密度比较

图3 急性皮损组和慢性难愈合创面各组大鼠伤后不同时间点创面组织中CXCL1表达情况(免疫组化染色,×200)

2.5各组大鼠创面组织中GM-CSF表达情况 急性皮损组与慢性创面组各时间点创面组织中GM-CSF表达平均光密度比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。急性皮损组伤后第3,7,14天创面组织中GM-CSF表达平均光密度比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。慢性创面组伤后第7天创面组织中GM-CSF表达平均光密度均明显低于伤后第3,14天(P均<0.05);贝复新组伤后第3,7,14天创面组织中GM-CSF表达平均光密度比较差异均无统计学意义(P均>0.05),但第7天有明显降低趋势;美宝组伤后第7,14天创面组织中GM-CSF表达平均光密度均明显低于伤后第3天(P均<0.05),且伤后第14天明显低于伤后第7天(P<0.05)。伤后第3天,美宝组创面组织中GM-CSF表达平均光密度明显高于贝复新组(P<0.05);伤后第7天,慢性创面组、贝复新组、美宝组创面组织中GM-CSF表达平均光密度比较差异均无统计学意义(P均>0.05);伤后第14天,与慢性创面组比较,美宝组创面组织中GM-CSF表达平均光密度明显降低(P<0.05),贝复新组有降低趋势但差异无统计学意义(P>0.05)。见图4及表4。

表4 急性皮损组和慢性难愈合创面各组大鼠伤后不同时间点创面组织中GM-CSF表达平均光密度比较

图4 急性皮损组和慢性难愈合创面各组大鼠伤后不同时间点创面组织中GM-CSF表达情况(免疫组化染色,×200)

3 讨 论

慢性难愈合创面形成可能与组织缺氧、缺血、感染、局部生长因子数量减少相关[7]。创面愈合包括止血、炎症反应、增殖、肉芽组织形成、再上皮化、血管生成以及基质重塑[8]。中医药在治疗慢性难愈合创面中有重要作用,MEBT/MEBO是其中主要并且有效的一种方法,它具有改善微循环、去腐生肌、促进创面再生与修复的作用,目前已广泛应用于临床[9]。

细胞外基质的平衡是创面愈合的关键,MMP-2是维持细胞外基质平衡的关键蛋白,在慢性伤口中处于高表达状态,且对胶原纤维降解和组织破坏有显著影响[10]。在本研究中,伤后第3天美宝组创面组织中MMP-2含量明显高于慢性创面组,之后降低,伤后第14天明显低于慢性创面组;Masson染色观察显示,美宝组创面组织中胶原纤维含量随伤后时间的延长逐渐增加,伤后第3天、第7天均明显高于慢性创面组和贝复新组,与MMP-2含量变化趋势呈负相关。其原因可能是在慢性难愈合创面早期,组织破坏严重,诱发MMP-2的高表达,而MMP-2高表达可抑制胶原纤维的生成,美宝在创面修复的后期能够降低MMP-2含量,从而促进创面的修复。

CXCL1由巨噬细胞、中性粒细胞和上皮细胞分泌,通过结合其受体 CXCR2 而对中性粒细胞起到趋化作用[11]。CXCL1可通过刺激中性粒细胞释放血管内皮生长因子(VEGF)促进血管生成,且CXCL1的表达会促进信号转导和转录激活因子3(STAT3)的表达和活化,而STAT3已被确定为VEGF基因启动子的直接转录激活因子,能够促进血管生成[12-13]。血管生成是创面修复的重要过程。在本研究中,与慢性创面组比较,美宝组伤后第3天创面组织中CXCL1表达量有升高趋势,但伤后第7,14天CXCL1表达量几乎没有变化,推测美宝可能在创面早期能够促进血管生成,但仍需要增加样本量或重复实验进行验证。

GM-CSF能够调控修复细胞和粒细胞、巨噬细胞的增殖分化,调节机体免疫功能,增强组织抵抗能力,改善创面局部炎症反应,在创面修复的各个阶段均发挥着不可或缺的作用[14]。大量研究发现,GM-CSF可通过诱导修复细胞募集到损伤区域并释放细胞因子,加速伤口愈合,在创面修复的炎症期,IL-1、IL-12、TNF-a等促炎因子可上调GM-CSF水平,IL-4、IL-10等抑炎因子均可下调GM-CSF水平[15]。在本研究中,美宝组伤后第3天创面组织中GM-CSF表达量明显升高,但随着时间的延长,GM-CSF表达量逐渐降低,推测美宝能够在创面早期促进GM-CSF表达,从而影响创面愈合。而在创面后期,创面炎症水平降低,促炎因子减少,GM-CSF表达也随之降低。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。