喉鳞状细胞癌组织中TIP30、DKK1表达与患者临床病理特征和预后的关系

施涛，王志顾，许莉，薛飞，陈伟，程友

东部战区总医院耳鼻咽喉头颈外科，南京 210002

喉癌是头颈部常见恶性肿瘤，近年来随着吸烟、饮酒比例的增加，喉癌发生率逐年升高，据流行病学统计，2020年我国新发喉癌病例29 135例，死亡15 814例［1］。喉鳞状细胞癌（LSCC）是喉癌最常见类型，占喉癌95%以上，尽管近年来LSCC的诊治取得一定进展，但患者预后仍较差［2-3］。tat结合蛋白30（TIP30）是一种人类免疫缺陷病毒结合蛋白，能调节肿瘤细胞增殖、迁移、凋亡等相关基因，抑制肿瘤细胞恶性行为。据报道，TIP30表达与肝癌、肺癌等恶性肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移有关［4-5］。dickkopf相关蛋白1（DKK1）是一种分泌型糖蛋白，能通过调控Wnt信号通路促进肿瘤细胞恶性行为［6］。有研究报道，DKK1表达与骨肉瘤、胆囊癌等恶性肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移有关［7-8］。目前，关于TIP30、DKK1表达与LSCC发生发展关系的报道较少。本研究拟探讨LSCC组织中TIP30、DKK1表达与病理特征和预后的关系，以期为改善LSCC患者预后提供参考。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2017年2月—2020年2月本院收治的103例LSCC患者，男90例、女13例，年龄34～81（60.54 ± 5.63）岁。肿瘤位置：声门上35例、声门54例、声门下14例；吸烟78例；饮酒60例；组织分化程度：中低分化55例、高分化48例；TNM分期［9］：Ⅰ～Ⅱ期63例、Ⅲ期40例；淋巴结转移28例。纳入标准：①经病理检查确诊为LSCC；②初次确诊；③入院前未接受任何抗肿瘤治疗；④患者及家属书面知情同意。排除标准：①喉转移癌或喉腺癌、腺鳞癌等其他喉癌类型；②合并其他部位恶性肿瘤；③合并急慢性感染或免疫、血液系统损害；④院内死亡、拒接随访、临床资料不完整。LSCC患者出院后通过电话或门诊随访3年（第1年3个月1次，然后6个月1次），随访截止死亡或2023年2月。本研究经医院伦理委员会批准（2016NKY012）。

1.2 LSCC组织中TIP30、DKK1表达检测 收集LSCC患者术中部分癌组织和癌旁组织，液氮下碾磨组织标本，TRIzol法（杭州昊鑫生物科技股份有限公司，编号：RN0102）提取组织总RNA，TaKaRa RNA PCR Kit试剂盒（北京麦瑞博生物科技有限公司，编号：RR001A-1）反转录合成cDNA，条件42 ℃ 1 h，95 ℃ 5 min。以cDNA为模板，参考SYBR®Premix Ex Taq™试剂盒（北京智杰方远科技有限公司，编号：DRR041A）说明书，使用实时荧光定量聚合酶链式反应分析仪［赛默飞世尔科技（中国）有限公司，型号：7500］进行扩增，TIP30正向引物：5′-CGGGTTTGTTC‐GTTCGGCT-3′，反向引物：5′-GTGCAGGGTCCGAG‐GTATT-3′；DKK1正向引物：5′-AAATCCCATCAC‐CATTCCAG-3′，反向引物：5′-TGATGACCCTTTTG‐GCTCCC-3′；GAPDH正向引物：5′-TGGTGTCGTG‐GAGTCG-3′，反向引物：5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′。反应体系共20.0 μL：cDNA模板1.0 μL、2×Master mix 8 μL、正向引物0.5 μL、反向引物0.5 μL、SYBR Pre‐mix Ex Taq 5.0 μL、RNase-free ddH25.0 μL；反应条件95 ℃ 90 s（循环1次），95 ℃ 30 s、63 ℃ 30 s、72 ℃ 15 s（循环40次）。以GAPDH为内参，2-ΔΔCT法计算组织中TIP30 mRNA、DKK1 mRNA相对表达量。根据LSCC组织中TIP30 mRNA、DKK1 mRNA表达均值分为高、低表达。

1.3 统计学方法 采用SPSS28.0统计软件。计量资料符合正态分布以表示，组间两两比较采用LSD-t检验；计数资料以例（%）表示，比较采用χ2检验；不同TIP30 mRNA、DKK1 mRNA表达LSCC患者生存曲线采用Kaplan-Meier法绘制；LSCC患者死亡的影响因素采用多因素Cox回归分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LSCC组织与癌旁组织中TIP30 mRNA、DKK1 mRNA表达比较 LSCC组织与癌旁组织中TIP30 mRNA相对表达量分别为1.08 ± 0.27、1.59 ±0.34，DKK1 mRNA相对表达量分别为1.81 ± 0.42、1.27 ± 0.32，LSCC组织中TIP30 mRNA表达低于癌旁组织，DKK1 mRNA表达高于癌旁组织，差异有统计学意义（t分别为11.823、10.367，P均<0.001）。TIP30 mRNA高表达（≥1.08）54例，低表达（<1.08）49例；DKK1 mRNA高表达（≥1.81）50例，低表达（<1.81）53例。

2.2 LSCC组织中TIP30 mRNA、DKK1 mRNA表达与患者临床病理特征的关系 不同分化程度、TNM分期、淋巴结转移LSCC组织中TIP30 mRNA、DKK1 mRNA表达比较差异有统计学意义（P均<0.05），见表1。

表1 LSCC组织中TIP30 mRNA、DKK1 mRNA表达与患者临床病理特征的关系（）

表1 LSCC组织中TIP30 mRNA、DKK1 mRNA表达与患者临床病理特征的关系（）

临床病理特征性别男女年龄≥60岁<60岁肿瘤位置声门上声门声门下吸烟是否饮酒是否组织分化程度中低分化高分化TNM分期Ⅰ、Ⅱ期Ⅲ期淋巴结转移有无n TIP30 mRNA相对表达量（images/BZ_6_1582_1938_1671_1989.png）t/F 0.186 P DKK1 mRNA相对表达量（images/BZ_6_1582_1938_1671_1989.png）P>0.05 t/F 0.260>0.05 90 13 1.08 ± 0.27 1.10 ± 0.26 1.81 ± 0.42 1.78 ± 0.38 0.858>0.050.803>0.05 81 22 1.07 ± 0.28 1.13 ± 0.23 1.83 ± 0.43 1.75 ± 0.37 0.264>0.050.583>0.05 35 54 14 1.11 ± 0.27 1.06 ± 0.28 1.10 ± 0.25 1.78 ± 0.39 1.85 ± 0.44 1.74 ± 0.41 0.079>0.050.059>0.05 78 25 1.08 ± 0.27 1.09 ± 0.26 1.81 ± 0.42 1.81 ± 0.40 0.167>0.050.233>0.05 60 43 1.08 ± 0.28 1.09 ± 0.25 1.82 ± 0.43 1.80 ± 0.40 2.405<0.052.391<0.05 55 48 1.02 ± 0.27 1.15 ± 0.26 1.90 ± 0.38 1.71 ± 0.43 2.698<0.052.759<0.05 63 40 1.14 ± 0.26 1.00 ± 0.26 1.72 ± 0.41 1.95 ± 0.39 3.111<0.053.519<0.05 28 75 0.95 ± 0.26 1.13 ± 0.26 2.04 ± 0.38 1.73 ± 0.40

2.3 LSCC组织中TIP30 mRNA、DKK1 mRNA表达与预后的关系 随访3年，103例LSCC患者失访4例（剔除），死亡31例，累积生存率为69.90%（72/103）。Kaplan-Meier生存曲线显示，TIP30 mRNA高表达者3年累积生存率高于低表达者；DKK1 mRNA高表达者3年累积生存率低于低表达者（Log-rankχ2分别为12.316、10.758，P均<0.05）。见图1。

图1 不同TIP30 mRNA、DKK1 mRNA表达LSCC患者K-M生存曲线

2.4 LSCC患者死亡的影响因素 根据LSCC患者存活状况分为死亡组31例与存活组68例，两组临床病理资料比较见表2。将表2有统计学差异因素作为自变量，随访时间为时间变量，生存状态（赋值：死亡为“1”；存活为“0”）为因变量。多因素Cox回归分析显示，中低分化、TNM分期Ⅲ期、淋巴结转移、DKK1 mRNA升高为LSCC患者死亡的独立危险因素（P均<0.05），TIP30 mRNA升高为独立保护因素（P<0.05），见表3。

表2 两组相关临床资料比较

表3 LSCC患者死亡的多因素Cox分析

3 讨论

LSCC是起源于喉黏膜上皮细胞的恶性肿瘤，可严重破坏患者语言功能、基本生理功能和外貌，由于早期症状非典型，导致超过60%的LSCC患者在初诊时处于局部晚期（TNM分期Ⅲ～Ⅳ期，除M1），手术治疗异常困难，且即使接受多学科的综合治疗，仍有40%～60%的局部晚期患者可出现复发或转移［10］。尽管近年来免疫和靶向治疗取得长足进展，已有获批用于LSCC治疗的药物，但随着临床的广泛使用，获得性耐药和不良反应越来越多，仍有部分患者难以获得临床效益［11］。

抑癌基因失活和促癌基因激活在LSCC发生发展中发挥重要作用［12］。p53是最早被发现的肿瘤抑制基因之一，能通过诱导细胞周期停滞、细胞凋亡和细胞衰老来调节细胞动态平衡，在多数人类恶性肿瘤中经常发生突变（部分或全部功能丧失）［13］。突变型p53不仅失去了正常的细胞增殖和分化调节功能，而且抑制了细胞的凋亡，促进了细胞的恶性转化，是LSCC恶变的早期重要事件［14］。TIP30是近年来新发现的一种肿瘤抑制基因，能通过磷酸化p53的C端或N端增强p53依赖的通路，促进内源性p53表达，调节细胞周期从G1向S期转化和抑制B淋巴细胞瘤-2/B淋巴细胞瘤xl，进而抑制肿瘤细胞增殖和促进其凋亡。刘庆伟等［15］研究报道，上调TIP30表达能抑制胃癌细胞增殖和促进其凋亡。本研究结果显示，LSCC组织中TIP30 mRNA表达下调，与分化程度、TNM分期、淋巴结转移有关，说明TIP30 mRNA低表达与LSCC发生、发展有关。分析原因可能是TIP30 表达下调会抑制p53转录活性和表达，使LSCC细胞绕过p53的抑瘤作用，促进LSCC细胞恶性进展［15］。

Wnt信号通路是一个高度保守的信号通路，控制细胞生长、分化、迁移、增殖、凋亡等多种生物学功能，细胞癌变时能激活Wnt并导致β-连环蛋白核易位，Wnt/β-连环蛋白信号通路能通过上皮间质转化、诱导肿瘤免疫耐受等促进肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭和存活［16］。DKK1是DKK家族中保守程度最高成员，最初研究发现DKK1能特异性与Kremen 蛋白、低密度脂蛋白相关蛋白5/6等Wnt蛋白竞争，阻断Wnt下游信号传导，最终导致β-连环蛋白降解，可能是肿瘤抑制基因［17］。近年研究发现，DKK1还能激活Wnt/β-连环蛋白信号通路，促进肿瘤恶性进展，在不同肿瘤中发挥抑癌或促癌作用［18］。如LONG等［19］研究报道，DKK1能抑制Wnt/β-连环蛋白信号通路抑制结直肠癌细胞增殖、迁移、侵袭和上皮间质转化。SONG等［20］研究报道，DKK1能激活Wnt/β-连环蛋白信号通路促进食管癌细胞增殖、迁移和侵袭。本研究结果显示，LSCC组织中DKK1 mRNA表达上调，与分化程度、TNM分期、淋巴结转移有关，说明DKK1 mRNA高表达与LSCC发生、发展有关。分析原因可能与DKK1 表达上调能激活Wnt/β-连环蛋白信号通路，促进LSCC细胞恶性进展有关［21］。

本研究通过分析TIP30 mRNA、DKK1表达与LSCC患者预后的关系发现，TIP30 mRNA高表达和DKK1 mRNA低表达者平均生存期延长，TIP30 mRNA高表达能降低LSCC患者死亡风险，DKK1 mRNA高表达会增加LSCC患者死亡风险，说明TIP30、DKK1与LSCC患者预后密切相关。

综上所述，LSCC组织中TIP30 mRNA表达降低，DKK1 mRNA表达升高，与肿瘤组织分化程度、TNM分期、淋巴结转移和预后有关。