卵巢癌组织中miR-581、FOXO1表达与患者病理特征和预后的关系

刘丽利，丁桂春，陆红梅，王奕芳

1 扬州市妇幼保健院生育技术科，江苏扬州 225000；2 扬州市妇幼保健院妇产科；3 扬州市妇幼保健院病理科

卵巢癌是妇科常见的恶性肿瘤。据2020年国际癌症研究机构报告，全球新发卵巢癌病例31.4万例，死亡20.7万例，我国新发卵巢癌病例5.5万例，死亡3.8万例。近年来随着人们生活方式的改变和人口老龄化的加剧，卵巢癌发病率逐年升高［1］。尽管近年来卵巢癌的诊治取得一定进展，但患者预后仍较差。研究表明，微小RNA（miRNA）等非编码RNA和细胞自噬、分化、周期异常等参与卵巢癌进展［2-3］。miR-581是一种保守miRNA。有学者报道，miR-581参与结直肠癌和食管鳞癌等恶性肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭与凋亡等过程［4-5］。叉头框转录因子O1（FOXO1）是一种转录因子，能通过调控基因转录参与细胞自噬、分化、周期、凋亡等调控［6］。有学者报道，FOXO1能抑制肺腺癌和胃癌等恶性肿瘤的恶性行为［7-8］。目前，关于卵巢癌组织中miR-581、FOXO1表达及临床意义报道不多。2017年1月—2019年10月，我们通过检测卵巢癌组织中miR-581、FOXO1表达，探讨二者与卵巢癌患者临床病理特征和预后的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2017年1月—2019年10月扬州市妇幼保健院收治的97例卵巢癌患者，年龄32～81（55.24 ± 8.32）岁；病理类型：浆液性癌77例、黏液性癌20例；肿瘤最大径：≥3 cm 38例、<3 cm 59例；分化程度：低分化36例、中高分化61例；国际妇产科联盟（FIGO）分期［9］：Ⅰ期18例、Ⅱ期20例、Ⅲ期59例；淋巴结转移42例。纳入标准：经病理检查结果证实为卵巢癌；初诊且未接受过抗肿瘤治疗；年龄≥18岁；患者或家属知情并签署同意书。排除标准：合并其他部位恶性肿瘤；合并血液、免疫系统损害；妊娠及哺乳期妇女；院内死亡或不能接受随访。本研究经医院伦理委员会批准（审批编号：2017002）。患者出院后通过门诊或电话随访3年，随访截至2022年10月或死亡。

1.2 卵巢癌组织中miR-581、FOXO1表达检测 术中切除部分卵巢癌组织和癌旁正常组织（距离癌组织≥3 cm），液氮冷冻后保存于-80 ℃冰箱中。取部分冻存组织，液氮下研磨成末，TRIzol法提取组织总RNA，鉴定RNA纯度、浓度合格后，使用TaKaRa RNA PCR Kit试剂盒（北京宝日医生物技术有限公司，编号：RR024A）合成cDNA。参考SYBR®Premix Ex Taq™试剂盒（北京智杰方远科技有限公司，编号：DRR041A）说明书进行扩增，引物设计和合成由北京环中睿驰科技有限公司完成。miR-581正向引物：5′-CTGATACATCGCTACTTCTG-3′，反向引物：5′-GTAATCTAACTACTCACACTA-3′；miR-581内参U6正向引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCG-3′；FOXO1正向引物：5′-CGGACGAGTACGAGAAGCG-3′，反向引物：5′-CGTAGCCAAAGACGAACATGC-3′；FOXO1内参GAPDH正向引物：5′-CGAGAGC‐TACACGTTCACGG-3′，反向引物：5′-GGGTGTC‐GAGGGAAAAATAGG-3′。反应条件：95 ℃ 90 s，95 ℃30 s、63 ℃ 30 s、72 ℃ 15 s，循环40次后收集Ct值，2-ΔΔCT法计算组织中miR-581、FOXO1 mRNA相对表达量。根据卵巢癌组织中miR-581、FOXO1 mRNA表达均值分为高、低表达，统计患者累积生存率。

1.3 统计学方法 采用SPSS28.0统计软件。正态分布计量资料以表示，比较采用t检验；计数资料以例（%）表示，比较采用χ2检验；Pearson相关系数分析卵巢癌组织中miR-581与FOXO1 mRNA表达的相关性；Kaplan-Meier法绘制不同miR-581、FOXO1 mRNA表达卵巢癌患者生存曲线，组间生存率比较采用Log-rank检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 卵巢癌组织与癌旁正常组织中miR-581、FOXO1 mRNA表达比较 卵巢癌与癌旁正常组织中miR-581的相对表达量分别为1.55 ± 0.25、1.14 ±0.22，FOXO1 mRNA的相对表达量分别为0.95 ±0.21、1.39 ± 0.28，卵巢癌组织中miR-581表达高于癌旁正常组织，FOXO1 mRNA表达低于癌旁正常组织（P均<0.05）。

2.2 卵巢癌组织中miR-581与FOXO1 mRNA表达的相关性 经TargetScan数据库7.2https：//www.targetscan.org/预测，miR-581与FOXO1的3′-非翻译区1 943～1 949、3 224～3 231处存在结合位点（图1）。Pearson相关系数分析显示，卵巢癌组织中miR-581与FOXO1 mRNA表达呈负相关（r=-0.728，P<0.05）。

图1 miR-876-5p与PAX6的结合位点图

2.3 卵巢癌组织中miR-581、FOXO1 mRNA表达与患者临床病理特征的关系 见表1。

表1 卵巢癌组织中miR-581、FOXO1 mRNA表达与患者临床病理特征的关系

2.4 卵巢癌组织中miR-581、FOXO1 mRNA表达与患者预后的关系 97例卵巢癌患者随访2～36个月，失访5例，死亡42例，3年累积生存率为56.70%（55/97）。miR-581高表达者（≥1.55）47例，miR-581低表达者（<1.55）50例；FOXO1 mRNA高表达者（≥0.95）49例，FOXO1 mRNA低表达者（<0.95）48例。Kaplan-Meier生存曲线分析显示，miR-581高表达者与低表达者的累积生存率分别为42.55%（20/47）、70.00%（35/50），miR-581高表达者累积生存率低于miR-581低表达者（χ2=8.059，P<0.05）。FOXO1 mRNA高表达者与低表达者的累积生存率分别为71.43%（35/49）、41.67%（20/48），FOXO1 mRNA高表达者的累积生存率高于FOXO1 mRNA低表达者（χ2=11.596，P<0.05）。

3 讨论

卵巢癌早期有的女性可能会出现阴道出血或排液、尿频或便秘等症状，但多数患者症状隐匿，临床中约70%的患者就诊时已处于晚期伴盆腔播散或淋巴结转移，手术治疗异常困难，即使所有学科合作也难以达到满意的癌细胞减灭效果，且术后多次化疗易反复复发，5年生存率仅40%［10］。尽管近年来随着基因检测的普及和靶向药物“多腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂”的应用，改变了卵巢癌治疗模式和延长了生存期，但仍有部分患者难以获得临床效益，且随着治疗时间延长获得性耐药和不良反应越来越多，影响患者预后［11］。

卵巢癌是一种异质性疾病，其发生、发展过程涉及表观遗传、癌基因激活、抑癌基因失活、基因转录后调控异常等诸多机制，miRNA是表观遗传学的一个新的研究热点，能通过与mRNA的3′-非翻译区互补或配对引发mRNA降解或转录后沉默，通过调控多种基因参与卵巢癌发生、发展［2-3］。miR-581定位于人5号染色体长臂11.2。研究报道，miR-581参与多种恶性肿瘤进展，如miR-581能靶向内质网降解增强α-甘露糖苷酶样蛋白1，诱导结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭［12］；miR-581能靶向ATP结合盒转运蛋白G1促进胆管癌细胞增殖和转移［13］。本研究结果显示，卵巢癌组织中miR-581高表达，与分化程度、FIGO分期、淋巴结转移和预后有关，提示miR-581高表达参与卵巢癌发生、发展。miR-581在卵巢癌组织中高表达的原因可能与miR-581启动子被卵巢癌内原癌基因激活和大量转录有关，而随着miR-581表达上调能通过与黏蛋白4相互作用，解离肿瘤细胞间的黏附作用，促使肿瘤细胞从原发病灶中解离，增强卵巢癌细胞侵袭和转移能力，进而促进卵巢癌进展［14］；同时miR-581高表达还能上调SMAD同源物7表达，刺激卵巢癌细胞上皮间质转化，促进卵巢癌细胞侵袭和转移，进而促进卵巢癌进展［15］。

卵巢癌是多种因素参与的复杂过程，与基因转录异常、DNA损伤修复、细胞周期阻滞、分化、凋亡、自噬等密切相关［16］。FOX是一类具有DNA结合区的转录因子家族，FOXO1是FOX家族重要成员，不仅能作为经典转录因子调节基因转录，还能协同其他转录因子参与转录调节，在DNA损伤修复、细胞周期阻滞、分化、自噬等方面发挥重要作用［6］。研究报道，FOXO1在肺腺癌、胃癌、结直肠腺癌等恶性肿瘤中低表达，上调FOXO1能抑制肿瘤细胞增殖、侵袭和血管生成［7-8，17］。本研究结果显示，卵巢癌组织中FOXO1 mRNA低表达，与分化程度、FIGO分期、淋巴结转移和预后有关，提示FOXO1 mRNA低表达参与卵巢癌发生、发展。FOXO1 mRNA在卵巢癌组织中低表达的原因可能与FOXO1启动子在卵巢癌内甲基化有关。有学者发现，卵巢癌内FOXO1的上游信号通路磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B失活，导致FOXO1启动子甲基化进而表达沉默［18］。本研究通过在线数据库预测发现，miR-581与FOXO1存在结合位点，进一步分析发现二者在卵巢癌组织中表达呈负相关，提示miR-581与FOXO1可能共同参与卵巢癌进展。高海宁等［19］研究报道，上调卵巢癌中miR-581表达能靶向下调FOXO1表达，抑制卵巢癌细胞自噬，进而促进卵巢癌发展。本研究随访发现，miR-581低表达和FOXO1 mRNA高表达的卵巢癌患者3年累积生存率更高，提示miR-581、FOXO1 mRNA表达与卵巢癌患者预后有关，有望成为卵巢癌患者预后评估的潜在指标。

综上所述，卵巢癌组织中miR-581高表达和FOXO1 mRNA低表达与临床病理特征及预后相关，二者可能共同参与卵巢癌进展，但本研究结果还需前瞻性多中心研究进一步验证。