基于生物信息学分析UBE2C与乳腺癌患者预后及免疫治疗反应的关系

应俊 王卫忠 赵钊 吕火烊

2022年发布的全球最新癌症负担数据显示，乳腺癌新发病例数达287万，已经成为全球第一大癌症[1]。在中国女性中，乳腺癌死亡人数排在癌症第4位，而在美国乳腺癌死亡人数已经攀升至第2位[2]。随着乳腺癌发病率和死亡率不断提升，乳腺癌防治日益得到各个国家的重视。近年来，免疫治疗在癌症治疗领域中开展得如火如荼，已成为治疗乳腺癌在内多种癌症的有效方法[3-5]。然而，由于肿瘤异质性及微环境的影响，只有部分患者能从免疫治疗中获益。因此，寻找乳腺癌特定的免疫相关生物标志物并发现新的免疫治疗靶点，在个体化免疫治疗方案选择、改善患者预后等方面具有重要意义。

泛素结合酶E2C（ubiquitin-conjugating enzyme E2C，UBE2C）作为泛素偶联酶E2家族成员，在泛素化依赖性蛋白水解中发挥重要作用，进而参与了包括细胞周期、信号转导和分化在内的多种细胞进程[6]。研究显示，UBE2C在乳腺癌组织中呈高表达，抑制UBE2C的表达能够抑制乳腺癌细胞的生长[7]。UBE2C与肿瘤耐药性密切相关，UBE2C过表达可能通过促进耐药相关基因的表达，使乳腺癌细胞对化疗药物的耐药性增加[8]。而且，UBE2C与乳腺癌的病理分级和复发等密切相关，在乳腺癌的早期诊断以及预后评估方面都具有重要的临床意义[9]。总之，UBE2C在乳腺癌的发生、发展中发挥着关键的作用，但UBE2C与乳腺癌的肿瘤微环境及免疫治疗之间关系的研究较少，是否可以作为乳腺癌的免疫治疗相关标志物还有待进一步的研究。本研究采用癌症基因组图谱（The Can‐cer Genome Atlas，TCGA）等数据库综合分析UBE2C在乳腺癌中的表达及其与患者预后的关系，探讨其与肿瘤微环境中免疫细胞浸润的关系，以阐明UBE2C在乳腺癌免疫治疗中的作用。

1 资料和方法

1.1 数据提取、差异及生存分析从TCGA中提取1 066例乳腺癌组织及112例癌旁正常乳腺组织的mRNA表达数据和临床病理特征，患者年龄45～71岁，男12例，女1 054例。对数据预处理后，提取UBE2C的表达数据，比较乳腺癌组织与癌旁正常乳腺组织之间UBE2C表达水平的差异。按照UBE2C的表达水平将乳腺癌患者分为UBE2C高表达组533例与UBE2C低表达组533例，利用R包“survival”比较两组乳腺癌患者总生存期（overall survival，OS）的差异。

1.2 UBE2C共表达基因分析及UBE2C高低表达组间差异基因筛选通过Pearson相关进行基因共表达分析，筛选标准为r＞0.6且P＜0.001，并对共表达结果进行可视化。采用Wilcoxon秩和检验比较UBE2C高表达组与低表达组之间的差异基因，筛选错误发现率（false discovery rate，FDR）＜0.05且两组间样本表达水平比值的对数绝对值（|log2Fold change|，|log2FC|）＞1的基因作为差异基因，并进行可视化。

1.3 差异基因的功能注释和富集分析利用R包“clusterProfiler”对UBE2C高表达组与低表达组间的差异基因进行基因本体（gene ontology，GO）分析及京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）分析，以探索差异基因的生物学功能及主要富集的信号通路，从通路来了解UBE2C在乳腺癌发生、发展中的功能。

1.4 免疫细胞浸润分析利用R包“CIBERSORT”计算每个肿瘤样本中免疫细胞的丰度，评估免疫细胞浸润水平，比较UBE2C高表达组与低表达组间免疫细胞浸润的差异。

1.5 UBE2C表达与肿瘤突变负荷（tumor mutation bur‐den，TMB）、免疫检查点基因的相关性分析使用R包“maftools”计算乳腺癌每个样本中每百万碱基中的肿瘤突变数得到TMB。通过Spearman秩相关分析UBE2C与TMB、文献检索所得常见免疫检查点基因的关系。

1.6 UBE2C表达与乳腺癌免疫治疗反应的相关性分析通过癌症免疫组图谱数据库（The Cancer Immu‐nome Atlas，TCIA）下载乳腺癌免疫组数据，量化肿瘤免疫原性和分析肿瘤免疫景观来预测乳腺癌的免疫治疗反应，通过数据库中患者的免疫治疗得分（immu‐nophenoscore，IPS）可以预测患者对细胞毒T淋巴细胞相关抗原4（cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4）及程序性死亡受体1（programmed cell death protein 1，PD-1）抑制剂为代表的免疫治疗反应差异。使用Wilcoxon秩和检验比较UBE2C高表达组与低表达组乳腺癌患者间IPS的差异。

1.7 外部数据验证UBE2C在乳腺癌中的作用使用TNM plot网络工具（https://tnmplot.com）中的乳腺癌芯片数据验证UBE2C在乳腺癌组织与正常乳腺组织中的差异。使用Kaplan-Meier Plotter在线工具（https://kmplot.com/analysis/）中的乳腺癌芯片数据评估UBE2C对乳腺癌患者生存的影响。利用蛋白质图谱数据库（The Human Protein Atlas，HPA）提供的免疫组化信息，在蛋白水平验证UBE2C在乳腺癌组织及正常乳腺组织中表达水平的差异。

1.8 统计学处理采用R 4.0.3统计软件。乳腺癌组织与癌旁正常乳腺组织间UBE2C的表达差异采用两独立样本t检验。UBE2C高表达组与UBE2C低表达组之间的差异基因筛选及免疫治疗反应的差异采用Wilcoxon秩和检验。采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，采用对数秩和检验比较组间OS的差异。相关性分析采用Pearson相关或Spearman秩相关。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 乳腺癌中UBE2C表达及预后分析通过比较TCGA数据库中UBE2C在乳腺癌组织和癌旁正常乳腺组织中的表达发现，UBE2C在乳腺癌组织中的表达水平明显高于癌旁正常乳腺组织（P＜0.01），见图1A。UBE2C高表达组患者的OS明显短于低表达组患者，差异有统计学意义（P＜0.05），见图1B。

图1 乳腺癌中UBE2C表达及预后分析（A：乳腺癌组织与癌旁正常乳腺组织中UBE2C表达差异，aP＜0.05；B：乳腺癌患者UBE2C高低表达组生存曲线的比较）

2.2 乳腺癌中UBE2C的功能分析共表达分析筛选出了乳腺癌中与UBE2C相关的基因，与UBE2C呈正相关的前6个基因分别为BIRC5、AURKB、TPX2、PTTG1、MYBL2、TROAP，与UBE2C呈负相关的前5个基因分别为CRY2、CYBRD1、KIF13B、NOSTRIN、WBP1L，见图2A（插页）。

图2 乳腺癌中UBE2C的功能分析（A：乳腺癌中UBE2C共表达基因；B：UBE2C高低表达组差异基因热图；C：差异基因GO分析；D：差异基因KEGG信号通路富集分析）

通过差异分析，UBE2C高表达组与低表达组间共筛选得到2 691个差异基因，其中1 478个基因的表达量在UBE2C高表达组中较UBE2C低表达组低，1 213个基因的表达水平在UBE2C高表达组中较UBE2C低表达组高，UBE2C高低表达组间上下调差异最明显的前50个基因热图见图2B（插页）。并对得到的2 691个差异基因进行GO、KEGG分析，结果发现差异基因可能在细胞的增殖、分裂和细胞因子活性及趋化因子活性中发挥重要作用，见图2C（插页）。KEGG信号通路主要富集在细胞因子相关的信号通路及IL-17相关信号通路，见图2D（插页）。

2.3 乳腺癌中UBE2C与免疫细胞浸润、TMB、免疫检查点相关性分析免疫细胞浸润分析发现，UBE2C高表达组中幼稚B细胞、静止的CD4记忆T细胞、单核细胞、M2巨噬细胞、静止的树突状细胞、静止的肥大细胞的浸润水平均明显低于UBE2C低表达组，而活化的CD4记忆T细胞、T滤泡辅助细胞、T调节细胞、M0巨噬细胞、M1巨噬细胞的浸润水平均明显高于UBE2C低表达组（均P＜0.01），见图3A（插页）；UBE2C与免疫细胞的相关性分析见图3B（插页），UBE2C与M1巨噬细胞等免疫细胞呈正相关，与M2巨噬细胞等免疫细胞呈负相关。乳腺癌中UBE2C的表达与TMB呈正相关，见图3C（插页）。免疫检查点相关性分析见图3D（插页），UBE2C与CTLA-4、LAG3和IDO1等免疫检查点呈正相关，与NRP1、CD220等基因呈负相关。

图3 乳腺癌中UBE2C与免疫功能相关性分析（A：UBE2C高低表达组中浸润免疫细胞差异柱状图，aP＜0.01；B：UBE2C与肿瘤微环境中浸润免疫细胞的相关性棒棒糖图；C：UBE2C与TMB相关性的散点图；D：UBE2C与免疫检查点相关性热图）

2.4 乳腺癌中UBE2C与免疫治疗反应相关性分析UBE2C高表达组对单独抗PD-1、抗CTLA-4的免疫治疗反应较UBE2C低表达组敏感，并且抗PD-1和抗CTLA-4的联合治疗显著改善了抗PD-1和抗CTLA-4单独治疗的治疗反应，见图4。

图4 乳腺癌UBE2C高低表达组免疫治疗反应差异（A：UBE2C高低表达组间CTLA-4负反应和PD-1负反应的IPS差异分析；B：UBE2C高低表达组间CTLA-4负反应和PD-1正反应的IPS差异分析；C：UBE2C高低表达组间CTLA-4正反应和PD-1负反应的IPS差异分析；D：UBE2C高低表达组间CTLA-4正反应和PD-1正反应的IPS差异分析）

2.5 乳腺癌芯片数据与免疫组化验证UBE2C在乳腺癌组织中的作用乳腺癌芯片数据分析结果与TCGA的乳腺癌测序分析结果一致，UBE2C在乳腺癌组织中的表达水平明显高于癌旁正常乳腺组织，并且UBE2C基因高表达组患者的OS明显短于低表达组患者。通过HPA数据库分析UBE2C蛋白在癌旁正常乳腺组织与乳腺癌组织中表达水平的差异，与TCGA的UBE2C mRNA的表达水平一致，乳腺癌组织中UBE2C的表达水平明显高于癌旁正常乳腺组织，见图5（插页）。

图5 乳腺癌芯片数据与免疫组化验证UBE2C在乳腺癌组织中的作用（A：TNM plot中的芯片数据研究乳腺癌组织与癌旁正常乳腺组织中UBE2C的表达差异；B：Kaplan-Meier Plotter中的芯片数据研究UBE2C在乳腺癌中的生存分析；C：UBE2C蛋白在癌旁正常乳腺组织中的表达，免疫组化染色，×40；D：UBE2C蛋白在乳腺癌组织中的表达，免疫组化染色，×40）

3 讨论

泛素化是细胞内靶蛋白降解的重要机制，对调控细胞周期、细胞程序性死亡、转录及肿瘤的发生、发展具有重要的作用［10］。UBE2C是泛素－蛋白酶体通路中的重要组成部分，在与肿瘤抑制基因和癌基因编码的蛋白降解有关的泛素蛋白酶途径中起着关键性作用。研究表明，在乳腺癌中UBE2C呈现高表达，导致癌症中的染色体错误分离和不受控制的细胞周期[11-12]。本研究通过生物信息学方法评估了TCGA数据库乳腺癌中的UBE2C表达，结果发现与癌旁正常乳腺组织相比，乳腺癌中的UBE2C表达水平明显增加，并且TNM plot中的乳腺癌基因芯片数据与HPA数据库中的免疫组化结果与TCGA测序数据一致。这些结果表明，UBE2C表达水平可作为乳腺癌的潜在诊断指标。为了确认UBE2C是否可以用作预后生物标志物，笔者通过TCGA乳腺癌测序数据与Kaplan-Meier Plot‐ter数据库中的乳腺癌芯片数据分析了UBE2C表达与OS之间的关系。分析结果表明，较高的UBE2C表达与乳腺癌较差的OS相关，表明UBE2C在乳腺癌发生、发展中的重要性。通过对UBE2C共表达基因及UBE2C高低表达组差异基因分析，发现UBE2C高低表达组之间的基因表达存在显著差异，而且与UBE2C相关的差异基因主要富集在细胞因子相关信号通路等免疫通路上，提示UBE2C可能在乳腺癌的免疫反应中发挥重要作用，可作为乳腺癌免疫治疗潜在的生物标志物。

乳腺癌的肿瘤微环境包括免疫细胞、成纤维细胞、炎性细胞和细胞外基质[13]。肿瘤微环境内浸润的免疫细胞不但影响肿瘤转移的发生和发展，还在肿瘤免疫治疗反应中起着重要作用[14-15]。通过免疫细胞浸润分析，结果证实了UBE2C基因与肿瘤微环境中的免疫细胞的相关性。肿瘤相关巨噬细胞是肿瘤微环境中最丰富的免疫细胞，巨噬细胞可以极化为两种类型：M1和M2。M1型巨噬细胞可以通过吞噬作用及介导Th1应答来杀死肿瘤细胞，抑制肿瘤细胞生长；而M2型巨噬细胞则通过产生细胞因子及介导Th2应答，促进组织修复、血管形成、产生免疫抑制，进一步助长了肿瘤的演进[16-17]。笔者通过免疫细胞浸润分析发现UBE2C高表达组中发挥免疫抑制及促肿瘤作用的M2巨噬细胞明显降低，而抑制肿瘤进展的M1巨噬细胞明显增加，表明UBE2C可能通过影响肿瘤微环境内的M1/M2巨噬细胞比例在乳腺癌发生和进展中发挥作用。然而，需要进一步的实验来揭示UBE2C调节肿瘤相关巨噬细胞浸润的潜在机制。

近年来，乳腺癌的免疫治疗取得了巨大进步，但缺乏能够精准预测免疫治疗疗效生物标志物[18]。因此，需要进一步加强基础和临床研究，以提高免疫治疗的疗效，并找到能够预测免疫治疗反应的生物标志物，以达到“个体化”的免疫治疗效果。UBE2C基因的表达或拷贝数变化会影响肿瘤微环境，可能在肿瘤的免疫应答中发挥重要作用。为了探索UBE2C预测乳腺癌患者免疫治疗反应的可能性，笔者评估了UBE2C与免疫检查点基因的关系，发现UBE2C与多个免疫检查点基因的表达具有相关性，可能在乳腺癌免疫治疗中发挥重要作用。TMB是指每百万碱基中被检出发生体细胞突变的总数。由于肿瘤体细胞突变而产生的新抗原，能诱导机体的抗肿瘤免疫反应。TMB是一种新兴的预测免疫治疗效果的指标。TMB高的患者在体内产生大量的抗原，对免疫治疗具有更大的临床益处。有研究指出，在高TMB的转移性乳腺癌患者中，免疫治疗反应性更好，但是难以定义的TMB界值是限制相关研究推进的因素之一[19]。本研究发现乳腺癌中UBE2C的表达与TMB呈正相关，表明UBE2C基因与乳腺癌免疫治疗之间的相关性。免疫治疗反应预测分析发现UBE2C高表达组对免疫检查点抑制剂抗PD-1和抗CTLA-4的治疗反应较UBE2C低表达患者更加敏感，表明UBE2C在乳腺癌的免疫治疗中起着重要作用，显示了UBE2C在预测乳腺癌免疫治疗反应方面的潜力。

综上所述，通过综合生物信息学分析，本研究发现UBE2C可以作为乳腺癌的潜在预后标志物，并且可以用来评估乳腺癌患者的免疫状态，可以根据UBE2C的表达对患者进行分层，在治疗前预测免疫治疗的有效性，以此为依据选择个体化的免疫治疗方案。