人牙龈间充质干细胞条件培养液对人成纤维细胞生物学功能的影响

张洁 杨华军 赵伟 蒋巧平 李敏 胡胜杰

皮肤创伤破坏了皮肤的屏障功能及生理功能，寻找促进皮肤创面愈合的方法一直以来是临床工作的重要内容。间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSCs）用于皮肤创面修复及组织再生医学有一定效果[1]。牙龈间充质干细胞（gingival mesenchymal stem cells，GMSCs）是从牙龈组织中分离出来的MSCs，与其他干细胞比较，具有取材方便，扩增能力强的优点，已证实用于牙周组织再生领域可发挥重要作用[2]。但调控这一生物学过程的内在机制并不明确。近年来随着对干细胞的深入研究，发现MSCs发挥生物学效应的主要途径与其旁分泌能力有关[3]。本研究将不同浓度的人牙龈间充质干细胞条件培养液（human gingival mesenchymal stem cells derived conditioned medium，GM‐SCs-CM）作用于成纤维细胞，探讨其对成纤维细胞生物学功能的影响，旨在为其用于促进皮肤创伤愈合的治疗提供实验和基础理论依据。

1 材料和方法

1.1 主要实验试剂及仪器DMEM培养基（美国Gib‐co公司）；基础培养基（上海赛百慷公司）；0.25%胰蛋白酶（美国Sigma公司）；青霉素-链霉素、PBS（上海源培生物科技有限公司）；CO2培养箱、4℃离心机（型号：ST16R）（美国Thermo公司）；SupersmartTM2×快速SYBR Green qPCR预混液、SupersmartTM6 min耐热首链cDNA合成试剂盒、SupersmartTM6 min高纯RNA提取试剂盒、SupersmartTMCell Counting Kit-8[中实基因科技（天津）有限公司]；引物[生工生物工程（上海）股份有限公司]；倒置荧光显微镜（天津微仪光学仪器有限公司）；LC96 qPCR仪（瑞士Roche公司）；CMax Plus酶标仪（SpectraMax）。

1.2 方法

1.2.1 细胞来源和培养GMSCs购自赛百慷生物技术股份有限公司，使用基础培养基传代培养，实验选用第3～4代细胞。人成纤维细胞为重庆医科大学赠送，使用DMEM培养基培养，实验选用第5代细胞。

1.2.2 GMSCs-CM制备将5×105个GMSCs接种在T25培养瓶中，用含血清替代物、血小板裂解物的生长培养基5 mL培养，2～3 d换液1次；当培养的细胞达80%融合时，去除原培养基，PBS漂洗3次，加入无添加剂的GMSCs基础培养基5 mL；培养48 h后收集细胞上清液于15 mL离心管中，500 r/min离心5 min，使用0.22 μm孔径滤过膜过滤，即得到GMSCs-CM；将收集到的GMSCs-CM采用Millpore超滤离心管浓缩（5 000 r/min，40 min，4℃），通过nanodrop仪测定浓度以备用。

1.2.3 细胞增殖实验采用CCK-8法。取对数生长期的人成纤维细胞，按2×104个/孔、100 μL/孔接种于96孔细胞培养板内，24 h后弃去培养液，分别用1、5、10、50、100 μg/mL浓度的GMSCs-CM进行细胞处理，每个浓度3个复孔，同时设置GMSCs-CM添加0 μg/mL为空白对照组，CO2培养箱继续培养72 h，弃去培养基，加入10 μL/孔CCK-8溶液，置于37℃、5% CO2的细胞箱孵育1 h，酶标仪检测450 nm波长处吸光度（optical density，OD）值。

1.2.4 细胞凋亡实验采用TUNEL法。将成纤维细胞按0.5×105个/mL密度接种在96孔板内，100 μL/孔。细胞贴壁后换无血清培养基，24 h后弃去培养液，加入0（空白对照组）、1、10、100 μg/mL浓度的GMSCs-CM，每个浓度3个复孔，孵育72 h后弃去上清液，PBS清洗细胞2次，采用TUNEL法检测细胞凋亡情况，凋亡细胞呈现绿色荧光信号。

1.2.5 Ⅰ型胶原（type I collagen，COL-1）、增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、α-平滑肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）mRNA的检测采用实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）法。将成纤维细胞按照105个/mL密度接种于24孔板上贴壁培养24 h，加入0（空白对照组）、1、10、100 μg/mL浓度的GMSCs-CM，孵育24 h后弃去培养液，20 μL PBS重悬，按照RNA提取试剂盒的操作提取总RNA，在50℃5 min进行第一链cDNA合成，95℃1 min进行反转录失活反应，得到cDNA进行qRT-PCR检测COL-1、PCNA、α-SMA、TGF-β mRNA。相关基因的引物序列见表1。

表1 实时荧光定量PCR中的引物序列

1.3 统计学处理采用SPSS 25.0及GraphPad Prism 9.0统计软件。计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Dunnett-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GMSCs-CM对成纤维细胞增殖能力的影响不同浓度GMSCs-CM作用下的OD值差异有统计学意义（F=6.163，P＜0.05）；1 μg/mL组成纤维细胞的增殖能力明显高于空白对照组（P＜0.05），与空白对照组比较，GMSCs-CM浓度是5、10、50、100 μg/mL时也能促进成纤维细胞增殖，但是差异均无统计学意义（均P＞0.05），见图1（插页）、表2。

图1 1 μg/mL GMSCs-CM作用72 h后成纤维细胞生长情况

表2 不同浓度GMSCs-CM作用下成纤维细胞增殖情况

2.2 GMSCs-CM对成纤维细胞凋亡情况的影响与空白对照组比较，成纤维细胞在不同浓度的GMSCs-CM作用下，细胞未发生明显的凋亡，见图2（插页）。

图2 不同浓度GMSCs-CM作用下成纤维细胞凋亡情况

2.3 不同浓度GMSCs-CM作用下成纤维细胞COL-1、PCNA、α-SMA、TGF-β mRNA表达水平的比较与空白对照组比较，GMSCs-CM浓度为1 μg/mL时COL-1 mRNA表达水平升高，差异有统计学意义（P＜0.05），而随着GMSCs-CM浓度的升高，COL-1 mRNA表达水平呈下降趋势。GMSCs-CM浓度为1 μg/mL时PCNA mRNA表达水平高于空白对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。而不同浓度GMSCs-CM作用下成纤维细胞α-SMA mRNA表达水平均低于空白对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。GMSCs-CM浓度为1 μg/mL时TGF-β mRNA表达水平高于空白对照组，而其他浓度作用下表达水平均低于空白对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。见表3。

表3 不同浓度GMSCs-CM作用下成纤维细胞COL-1、PCNA、α-SMA、TGF-β mRNA表达水平的比较

3 讨论

皮肤创面愈合对维持皮肤完整性和功能性起至关重要的作用。MSCs在皮肤创面修复及组织再生医学中取得了一定的效果，是目前临床中最有价值的医疗手段。GMSCs是从牙龈中分离出的MSCs，较其他来源的成体干细胞取材方便，同时临床中发现，口腔黏膜的自身修复速度比皮肤修复速度快且很少形成瘢痕，推断这与GMSCs的生物学特性相关，但调控这一生物学过程的内在机制并不明确。近年来随着干细胞的深入研究显示，MSCs发挥生物学效应的主要依靠其旁分泌能力，通过旁分泌携带特异性信息的传导，调节靶细胞的生物学状态。MSCs-CM的使用避免了MSCs移植产生的免疫原性高、致瘤和致畸风险、直接注射会造成血管栓塞等不良反应，相比MSCs移植更加安全方便，更具有临床转化前景。基于此，笔者推测旁分泌也是GMSCs发挥修复作用的重要媒介。本研究通过使用不同浓度的GMSCs-CM作用成纤维细胞发现，GMSCs-CM对成纤维细胞的增殖能力有明显的促进作用，而对细胞凋亡无明显影响。

皮肤创面愈合过程涉及到炎细胞浸润、不同细胞的相互作用、细胞外基质的沉积和重塑、上皮的再生等，其中成纤维细胞在皮肤创面愈合中的调节作用占主导地位[4]。在创面愈合初期炎细胞浸润，起主要作用的中性粒细胞、巨噬细胞分泌炎症因子如TGF、成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）、表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）等来作为趋化剂招募组织形成阶段所需的细胞和细胞因子，成纤维细胞募集到创面后在细胞因子的调节下进行肉芽组织的生成、血管的形成与上皮的再生[5]。

正常皮肤中的成纤维细胞数量基本恒定，皮肤损伤后，成纤维细胞生长快速地由G0期进入增殖期，以促进再生上皮化的进程从而加速创面的愈合[6]。本实验研究表明，GMSCs-CM能显著促成纤维细胞的增殖，以此影响创面愈合的再生上皮化过程。

合成COL-1的能力是成纤维细胞的典型特征，COL-1也是细胞外基质的主要成分，约占其比重的70%。在正常成人皮肤中，胶原蛋白Ⅰ与胶原蛋白Ⅲ的比例约为4∶1，在新愈合的人体皮肤中，胶原蛋白Ⅰ和胶原蛋白Ⅲ的比例约为1∶1[7]。本实验研究结果显示，在皮肤创面愈合过程中，GMSCs-CM不同浓度作用下成纤维细胞COL-1 mRNA表达水平均升高；同时发现GMSCs-CM能有效增加COL-1的表达，促进成纤维细胞的增殖，从而加速伤口愈合，且GM‐SCs-CM浓度为1 μg/mL时COL-1 mRNA表达水平最高，而随着GMSCs-CM浓度的升高，COL-1 mRNA表达水平呈下降趋势，提示1 μg/mL GMSCs-CM浓度是增加COL-1的表达促进成纤维细胞增殖的最适浓度。

TGF-β是创面愈合生理学中的一组关键细胞因子，它全程参与调节创面愈合过程的3个阶段：（1）在伤口愈合早期，TGF-β由免疫细胞分泌，充当免疫细胞的化学引诱物，调节免疫细胞功能，从而有助于炎症消退；（2）在组织形成期，TGF-β通过刺激内皮细胞迁移、分化和毛细血管形成来促进血管生成[8]，同时还刺激成纤维细胞增殖，促进成纤维细胞转分化为肌成纤维细胞，并刺激细胞外基质产生，促进再生上皮化；（3）基质重塑阶段，TGF-β通过一系列严格调控，使得细胞外基质合成和降解维持平衡状态。PCNA是DNA复制和修复的重要因素，作为评价细胞增殖状态的重要指标，已证实在皮肤组织的发生和修复过程中表达增强[9]。本研究中也发现，1 μg/mL GMSCs-CM可促进TGF-β mRNA和PCNA mRNA的表达水平。

伤口愈合的中后期，成纤维细胞由原型肌成纤维细胞分化为肌成纤维细胞，肌成纤维细胞是表达α-SMA的特化细胞[10]，它响应TGF的刺激并促进创面的收缩，使肉芽组织纤维化[11]。本实验研究发现，GMSCs-CM组细胞α-SMA mRNA表达水平均低于空白对照组，随着GMSCs-CM浓度的增加，α-SMA mRNA表达水平也逐渐增加。提示在创面愈合过程中提高GMSCs-CM的浓度可导致成纤维细胞纤维化，从而促进皮肤创面的收缩。

综上所述，GMSCs-CM含有大量GMSCs分泌的生物活性物质，可调节成纤维细胞的生物活性状态从而促进皮肤创面的愈合。同时，GMSCs-CM中细胞因子的浓度具有可调控性，若通过全身或者局部给药的方式精准作用于皮肤创面，可使GMSCs-CM的使用更加安全更具有临床转化前景。在此过程中，COL-1和TGF-β表达调控的机制有待进一步阐明，或可成为创面愈合的潜在治疗策略。