甲状腺乳头状癌组织中miR-137水平表达及相关实验研究

薛思军，涂霁韬（黄石市中心医院/湖北理工学院附属医院 .普通外科；.急诊科，湖北黄石 435000）

甲状腺癌(thyroid cancer)作为头颈部常见的内分泌肿瘤，发病率不断上升，且女性人群占比较高[1]。其中，约90%的病理类型是乳头状癌（papillary carcinoma），临床上主要采取手术切除治疗，多数患者术后预后良好，但部分患者由于出现淋巴结转移及复发而死亡[2]。微小核糖核酸（microRNA，miR）是一种含20 个左右核苷酸序列的短链RNA，可通过调控靶基因表达而参与细胞多种生物学功能[3]，同时，多种疾病发生与miRNA 表达异常有关[4]，有研究指出[5]，miRNA 亦参与了甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinoma,PTC）患者的基因调控。近年来研究发现，miR-137 作为一种调控因子参与了与细胞周期、增殖、分化、侵袭等相关的基因表达[6]，在恶性肿瘤细胞生长及转移中发挥抑癌基因的作用[7]。然而目前，关于miR-137是否参与PTC 病程鲜有报道。本研究分析了PTC患者组织中miR-137 表达，并通过对人PTC 细胞株TPC-1 转染miR-137 模拟物，观察细胞增殖及侵袭能力的变化。

1 材料与方法

1.1 研究对象 收集2018 年4 月～2021 年4 月在黄石市中心医院普爱院区手术切除的121 例PTC及配对癌旁组织，快速放在液氮中，-80℃保存。患者术前均未行任何治疗，术后病理检查确证，排除急慢性感染、其他系统恶性肿瘤及心肝肾等重要脏器功能不全者。男性36 例，女性85 例；平均年龄50.82±7.89 岁；病灶：单个64 例，多个57 例；发生淋巴结转移49 例。本研究通过医院伦理委员会审批，患者签署知情同意书。TPC-1 细胞（上海传秋生物公司），保存于液氮中。

1.2 仪器与试剂 Trizol 和Lipofectamine 2000 转染试剂（美国Invitrogen 公司），反转录和SYBR Green qPCR Master Mix 试剂盒（上海复申生物公司），miR-137 和U6 引物由武汉百齐生物公司设计合成，胎牛血清和胰蛋白酶（美国Gibco 公司），DMEM 和MTT 液（美国Sigma 公司），miR-137模拟及阴性对照序列由上海吉玛公司设计合成，Transwell 小室及基质胶（美国Corning 公司），7500 实时荧光定量PCR 仪（美国ABI 公司）。

1.3 方法

1.3.1 qRT-PCR 法检测组织中miR-137 表达：取组织50mg，剪碎、研磨，加入细胞裂解液，用Trizol 试剂提取总RNA，紫外分光光度法检测纯度和浓度合格后，使用反转录试剂盒将总RNA 合成cDNA，并以其为模板按SYBR Green qPCR Master Mix 试剂盒说明，用实时荧光定量PCR 仪扩增引物。反应条件：95℃ 5min，95℃ 20s，55℃ 30s，70℃30s，循环40 次，使用2-△△Ct法计算组织中miR-137 表达水平进行相对定量。miR-137 和U6 引物序列见表1。

表1 引物序列

1.3.2 细胞培养和处理：取TPC-1 细胞，用DMEM 培养液（含胎牛血清100ml/L）培养，条件：5% （v/v）CO2,37℃，传代培养。将对数生长的细胞接种在6 孔板，用转染试剂进行分组处理：①miR-137 模拟物组（M 组）：转染miR-137 模拟序列：5’-ACATCGTCTCTCATAGCAATAT-3’；②阴性对照组（NC 组）：转染阴性对照序列：5’-ACGU GACACGUUCGGAGAATT-3’；③空白组（B 组）：仅加入转染试剂。处理后继续培养48h。

1.3.3 qRT-PCR 法检测细胞中miR-137 表达：取处理后48h 的细胞，加入裂解液，其他操作步骤同上述1.3.1 中qRT-PCR 操作。

1.3.4 MTT 法检测细胞增殖活性：取各组处理后细胞，消化，接种在96 孔板，密度2.0×103/孔，每组设复孔6 个，分别在培养12，24，48，72 和96h 时，各孔各加入MTT 液10μl，孵育4h 后弃上清，各加入二甲基亚砜150μl，振荡至结晶物溶解完全，酶标仪检测各孔在490nm 的吸光度A值。

1.3.5 Transwell 法检测细胞迁移力：将各组处理后细胞离心，取沉淀，用不含胎牛血清培养液按2.5×104/ml 重悬，取200μl 加入小室上室，下室则加入含10ml/dl 胎牛血清的培养液600μl。培养24h。擦拭小室膜上层散落细胞，膜下细胞则用4g/dl多聚甲醛固定，加入1g/dl 结晶紫染色，用倒置显微镜观察，随机选视野5 个计数穿膜细胞数。重复实验三次。

1.3.6 Transwell 法检测细胞侵袭力：将培养液稀释过的基质胶平铺在小室上层，37℃下风干使用。其他操作同方法1.3.5 中细胞迁移力测定的方法。

1.4 统计学分析 数据统计分析使用SPSS 13.0 软件，计量资料经检验均符合正态分布，以均数±标准差（±s）表示，采用t检验进行两组间比较，采用单因素方差分析进行多组间比较，组间进一步两两比较采用LDS-t检验，采用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线分析PTC 组织中miR-137 对PTC 的诊断价值。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PTC 和癌旁组织中miR-137 水平比较 PTC组织中miR-137 水平为0.26±0.10，显著低于癌旁组织的0.42±0.18，差异有统计学意义（t=8.320，P＜0.001）。

2.2 PTC 组织中miR-137 水平与临床指标相关性见表2。miR-137 水平在不同性别、年龄、是否吸烟、是否饮酒、不同病灶数量及肿瘤直径差异均无统计学意义（均P＞0.05）；与无包膜浸润、TNM分期Ⅰ～Ⅱ和未发生淋巴结转移患者相比，包膜浸润、TNM 分期Ⅲ～Ⅳ和发生淋巴结转移PTC 组织中miR 137 水平降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。

表2 PTC 组织中miR 137 水平与临床指标相关性（±s）

表2 PTC 组织中miR 137 水平与临床指标相关性（±s）

项 目nmiR-137 表达量tP性别男360.27±0.10 1.003 0.318女850.25±0.09年龄（岁）≥51700.25±0.09 1.744 0.084＜51510.28±0.10吸烟是290.24±0.11 1.279 0.203否920.27±0.09饮酒是350.28±0.10 1.159 0.249否860.25±0.09病灶数量单个640.25±0.10 0.759 0.449多个570.27±0.09肿瘤直径（cm） ≥1840.25±0.09 1.707 0.090＜1370.28±0.10包膜浸润是460.22±0.09 3.506 0.001否750.28±0.09 TNM 分期Ⅰ～Ⅱ800.27±0.10 2.210 0.029Ⅲ～Ⅳ410.23±0.08淋巴结转移是490.24±0.09 2.110 0.037否720.28±0.10

2.3 组织中miR-137 水平对PTC 的诊断价值 见图1。ROC 曲线分析结果显示，miR-137 表达量在诊断PTC 时，曲线下面积是0.776（95% CI：0.717～0.835），当miR-137 表达量取0.35 时，灵敏度和特异度分别为80.99%，65.29%。

图1 PTC 组织中miR-137 水平对PTC 的ROC 曲线

2.4 各组细胞中miR-137 水平比较 M 组、NC 组和B 组细胞中miR-137 水平分别为2.30±0.19，1.01±0.05 和1.03±0.08，差异有统计学意义（F=222.632，P＜0.001）；NC 组和B 组细胞中miR-137水平差异无统计学意义（t=0.690，P=0.506），M组细胞中miR 137 水平高于NC 组和B 组，差异有统计学意义（t=16.319，15.117，P＜0.05）。

2.5 各组细胞增殖活性比较 见表3。M 组24，48，72和96h时增殖活性低于NC组（t=2.570，2.520，2.969，4.095），且低于B 组（t=2.779，3.964，4.681，3.782），差异均有统计学意义（均P＜0.05）。NC组和B 组24，48，72 和96h 时增殖活性比较差异无统计学意义（t=0.297，0.893，1.712，0.949，均P＞0.05）。

表3 三组细胞不同时点增殖活性（A 值）

2.6 各组细胞迁移和侵袭力比较 见表4，图2 和图3。M 组迁移细胞数和侵袭细胞数均低于NC 组（t=7.316，5.555） 和B 组（t=6.118，8.078），差异均有统计学意义（均P＜0.05），NC 组与B 组迁移细胞数和侵袭细胞数比较差异无统计学意义（t=0.0839，1.381，均P＞0.05）。

图2 Transwell 法检测三组细胞迁移情况（A：M 组，B：NC 组，C：B 组，结晶紫×200）

图3 Transwell 法检测三组细胞侵袭情况（A：M 组，B：NC 组，C：B 组，结晶紫×200）

表4 三组细胞迁移和侵袭能力比较（x± s，个）

3 讨论

随着人民健康意识的提高，甲状腺癌检出率不断增加，且发病年龄呈低龄化[8]，PTC 作为其中占比最高的病理类型，患者病程进展缓慢，手术切除后长期预后良好[9]，但术后复发率较高，部分患者面临再次或多次手术风险[10]，同时，对于发现较晚出现转移的患者，治疗后效果不佳[11]，因此，进一步探讨明确与PTC 转移及复发相关机制，寻找敏感靶点基因，对早期诊疗及预后改善意义重大。

研究发现[12]，PTC 组织中存在miRNA 表达谱异常，可能对患者诊断、预后评估有重要意义。研究发现[13]，miR-137 与肿瘤细胞增殖关系密切，可通过影响靶基因稳定性而在细胞增殖中发挥重要作用。有研究指出[14]，miR-137 可通过影响上皮-间质转化而参与了肿瘤细胞侵袭。亦有研究指出[15]，miR-137 可抑制宫颈癌进展。张长壮等[16]指出，miR-137 与乳腺癌患者临床病理特征及术后应用ACT 方案化疗后疗效有关。本研究结果显示，PTC组织中miR-137 表达量显著低于癌旁组织，说明miR-137 在PTC 组织中低表达，可能参与了PTC发生。本研究结果显示，miR-137 在包膜浸润、TNM 分期Ⅲ～Ⅳ和发生淋巴结转移PTC 组织中表达量显著降低，进一步说明miR-137 与PTC 患者临床病理特征有关，并对诊断PTC 具有一定意义，低表达可能参与了PTC 恶性进程，在PTC 进展中发挥抑癌基因的作用。

本研究为进一步探讨miR-137 在PTC 发病中的作用，采用转染模拟序列的方式升高人PTC 细胞株TPC-1 中miR-137 表达，结果显示，M 组细胞中miR-137 表达量高于NC 组和B 组，说明转染miR-137 模拟序列的细胞中miR-137 表达量升高，提示建模成功。研究发现[17]，miR-137 表达增加可显著抑制细胞增殖，降低集落形成并诱导G1 期停滞。本研究结果显示，M 组24，48，72 和96h 时增殖活性均低于NC 组和B 组，说明TPC-1 中miR-137 表达升高可有效降低细胞增殖活性，提示miR-137 可能在TPC-1 细胞增殖中发挥抑制作用。有研究指出[18]，miR-137 在体外和体内通过靶向肝癌细胞中的EZH2-STAT3 信号通路抑制迁移和侵袭。DING 等[19]指出，miR-137 可通过调节上皮间质转化抑制大肠癌细胞迁移。本研究实验结果发现，M组迁移细胞数和侵袭细胞数均低于NC 组和B 组，说明增加miR-137 表达可抑制TPC-1 细胞迁移和侵袭，可能在细胞迁移及侵袭中发挥重要作用。

综上所述，miR-137 在PTC 组织中表达量降低，升高miR-137表达可明显减少TPC-1细胞增殖活性，抑制细胞迁移和侵袭，但其具体可能涉及到的通路尚待开展进一步的研究明确。