糖尿病足溃疡患者血清Hsa_circ_0080425表达水平与疾病严重程度及预后的关系研究

黎珊珊，李 珍，谢桃梅，谢雪花，李文霞（儋州市人民医院内分泌代谢科，海南儋州 571179）

糖尿病足溃疡（diabetes foot ulcer,DFU）是糖尿病患者常见的并发症，可出现足部感染、溃疡或深层组织破坏，对患者肢体功能和生活质量造成极大影响[1]。因此，寻找一种有效评估DFU 严重程度及预后的生物学指标对疾病诊疗具有重要意义。DFU 的发病机制复杂，多数学者认为氧化应激反应、炎性因子及表观遗传学与DFU 的发生发展有关[2-3]。外周血环状RNA（hsa_circular RNA，Hsa_circ）是一种新型的非编码RNA，在2 型糖尿病（T2DM）及其并发症的发生发展中起到重要调节作用，可为糖尿病及其并发症的早期诊断和治疗提供新的思路[4]。近年来研究发现，Hsa_circ_0080425 在糖尿病患者中存在异常表达，其表达水平变化与疾病进展有关，对预测糖尿病并发症发生及预后具有重要帮助[5]。然而，关于Hsa_circ_0080425 在DFU 中的应用价值尚未清楚。为此，本研究通过分析DFU患者血清Hsa_circ_0080425 表达情况，分析其与DFU 病情严重程度的关系及预测DFU 患者预后不良的价值，旨在为临床防治 DFU 提供依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取2020 年1 月～2022 年12 月儋州市人民医院收治的DFU患者110例，男性62例，女性48 例，年龄38～85（59.72±10.84）岁。纳入标准：①DFU 诊断参考《中国糖尿病足防治指南(2019 版)》[6]；②首次发病就诊,病因均为T2DM。排除标准：①并发严重心脑肺疾病、精神疾病、自身免疫疾病及恶性肿瘤；②近三个月内有大手术史，存在溃疡癌变。本研究经我院伦理委员会批准，患者知情同意。

1.2 仪器和试剂 FQD-96A 荧光定量PCR 仪（杭州博日科技股份有限公司），逆转录试剂盒、PCR试剂盒和Trizol 试剂盒（Qiagen 公司），680 型酶标分析仪（BIO-RAD 公司），CL-2200i 迈瑞全自动化学发光免疫分析仪（深圳迈瑞公司），AU680型生化分析仪（贝克曼库尔特）。

1.3 方法

1.3.1 临床分组：参考《DFU的Wagner分级标准》[7]，110 例DFU 患者分为1 级（n=24），2 级（n=28），3 级（n=23），4 级（n=27），5 级（n=8）；其中1 级为轻度，2～3 级为中度，4～5 级为重度。DFU 感染严重程度参考《美国感染疾病协会关于糖尿病足感染的临床分级标准》[8]，分为1 级（n=6，无感染），2 级（n=30，轻度感染），3 级（n=47，中度感染），4 级（n=27，重度感染）。随访DFU患者6 个月的预后情况，其中预后良好组66 例(溃疡愈合)，预后不良组44 例（未愈合22 例，截肢16 例，死亡6 例）。

1.3.2 观察指标：采集研究对象的血标本5 ml，3 500 r/min 离心10 min（离心半径13.5 cm），分离血清置于-70℃冰箱保存待测。应用实时荧光定量聚合酶链反应（real time PCR，RT-PCR）技术检测Hsa_circ_0080425，反应条件为：95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸60 s，共40 个循环。采用2-△△Ct法计算Hsa_circ_0080425 表达水平。另采用化学发光免疫分析法检测降钙素原（procalcitonin，PCT）水平；免疫散射比浊法检测C-反应蛋白(C-reactive protein，CRP)水平。

1.4 统计学分析 采用SPSS 22.0 统计软件，正态分布计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验。计数资料采用χ2检验。应用多因素Logistic 回归分析影响DFU 患者预后不良的危险因素。绘制受试者工作特征曲线（ROC）分析Hsa_circ_0080425，CRP 及PCT 预测DFU 患者预后不良的价值。相关性分析采用Spearman 相关。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DFU 患者预后不良组和预后良好组临床资料及实验室指标比较 见表1。预后不良组DFU 病程、Wagner 分级、感染程度分级、空腹血糖、糖化血红蛋白、CRP，PCT 及Hsa_circ_0080425 水平均明显高于预后良好组，差异具有统计学意义（均P＜0.05）。

表1 DFU 患者预后不良组和预后良好组临床资料及实验室指标比较 [n（%），（±s）]

表1 DFU 患者预后不良组和预后良好组临床资料及实验室指标比较 [n（%），（±s）]

项目预后良好组（n=66）预后不良组（n=44）χ2/t/Z 值P 值男性36（54.5）26（59.1）0.2220.638年龄（岁）58.90±10.4660.42±10.730.8510.476体质指数（kg/m2）23.48±3.1723.10±3.140.6750.559 DFU 病程（周）4.35±2.626.95±4.309.812＜0.001 Wagner 分级 1 级21（31.8）3（6.8）31.658＜0.001 2～3 级39（59.1）12（27.3）4～5 级6（9.1）29（65.9）感染程度分级 1～2 级29（43.9）7（15.9）3～4 级37（56.1）37（84.1）9.4210.002溃疡面积（cm2）6.24±2.506.68±2.731.5710.096白细胞计数（×109/L）10.85±3.7411.53±4.281.0700.320空腹血糖（mmol/L）8.46±2.7010.25±3.687.813＜0.001糖化血红蛋白（%）7.12±1.659.37±2.149.215＜0.001 CRP（mg/L）28.62±8.7057.35±16.8212.847＜0.001 PCT（ng/ml）0.25±0.120.93±0.2614.513＜0.001 Hsa_circ_00804250.81±0.241.96±0.8517.984＜0.001

2.2 不同感染程度DFU 患者血清Hsa_circ_0080425表达水平比较 3～4 级DFU 患者血清Hsa_circ_0080425 表达水平为1.72±0.58，明显高于1～2级患者的1.06±0.30，差异有统计学意义（t=11.820，P＜0.001）。

2.3 不同病情严重程度DFU 患者血清Hsa_circ_0080425 表达水平比较 DFU 患者随着Wagner 分级增加，Hsa_circ_0080425 表达水平逐渐升高(4～5级＞2～3 级＞1 级；2.28±0.94＞1.57±0.53＞0.68±0.05），差异有统计学意义（F=24.716）；4～5级明显高于2～3 级和1 级，且2～3 级明显高于1 级，差异均有统计学意义（t=10.475，19.382，11.394，均P＜0.001）。

2.4 多因素Logistic 回归分析影响DFU 患者预后不良的危险因素 见表2。以DFU 患者是否预后不良为因变量，将所有影响因素为自变量进行多因素Logistic 回归分析，结果显示DFU 病程长，Wagner 4～5 级、感染程度3～4 级、空腹血糖、糖化血红蛋白以及CRP，PCT，Hsa_circ_0080425水平升高是影响DFU 患者预后不良的危险因素（均P＜0.05）。

表2 多因素Logistic 回归分析影响DFU 患者预后不良的危险因素

2.5 Hsa_circ_0080425，CRP 及PCT 预测DFU 患者预后不良的价值 见表3 和图1。血清Hsa_circ_0080425 表达水平预测DFU 患者预后不良的最佳截断值为1.60，其曲线下面积（AUC）均大于CRP（Z=7.183，P＜0.001） 和PCT（Z=5.962，P＜0.001），敏感度和特异度分别为88.0%，84.2%。

图1 Hsa_circ_0080425，CRP 及PCT 预测DFU 患者预后不良的ROC 曲线

表3 Hsa_circ_0080425，CRP 及PCT 预测DFU 患者预后不良的价值

2.6 DFU 患者血清Hsa_circ_0080425 表达水平与感染分级和Wagner分级的相关性 相关分析显示，DFU 患者血清Hsa_circ_0080425 表达水平与感染程度分级、Wagner 分级呈正相关（r=0.706，0.775，均P＜0.001）。

3 讨论

DFU 是一种复杂的慢性疾病，由血糖控制不良、周围神经病变、周围血管疾病和免疫抑制引起，其中circular RNA 通过复杂的网络作为调节元件发挥作用。circular RNA 是一类共价闭合环的RNA 分子，广泛参与机体及细胞代谢过程，在T2DM 及其并发症中发挥很大作用[9]。TANG 等[10]研究发现，circular RNA 表达异常与DFU 的加速发展和伤口愈合延迟有关，其作用在DFU 伤口愈合的不同阶段，可作为DFU 治疗的潜在靶点。另有研究认为，Hsa_circ_0080425 异常表达与周围神经和微血管病变有关，在糖尿病并发症中发挥重要作用，有望成为新的分子标志物[11]。CRP 及PCT 作为临床常用的感染指标，有助于诊断及鉴别感染类型，对评估DFU 严重程度及病情变化具有一定价值[12]。

本研究显示，中重度感染DFU 患者血清Hsa_circ_0080425 表达水平均明显高于轻度感染患者，而且随着Wagner 分级增加，DFU 患者Hsa_circ_0080425 表达水平逐渐升高，提示Hsa_circ_0080425高表达与DFU 患者病情严重程度密切相关。相关分析也显示，DFU 患者血清Hsa_circ_0080425 表达水平与感染程度分级和Wagner 分级均呈正相关。说明Hsa_circ_0080425 表达水平与DFU 的发生发展有关，对疾病进展有重要影响。这可能是Hsa_circ_0080425 高表达促进血管内皮损伤，影响了溃疡组织处神经和微血管环境，从而加重DFU的病情进展，且随着Hsa_circ_0080425 水平越高该作用越强。TIAN 等[13]研究认为，circular RNA异常表达与DFU 创面的愈合过程及预后有关，对DFU 发生发展产生极大影响。本研究预后不良组Hsa_circ_0080425 水平明显高于预后良好组，Hsa_circ_0080425 高表达是DFU 患者预后不良的主要危险因素，这可能是Hsa_circ_0080425 参与DFU 的炎症调控、血管增殖和再生，其高表达影响了DFU创面愈合。本研究CRP 及PCT 水平升高均对DFU预后造成影响，提示炎症反应与DFU 病情进展具有相互促进的作用，炎症反应可加剧微血管病变，加重下肢缺血程度。感染程度分级和Wagner 分级作为临床上评估DFU 病情严重程度的重要参考指标，其中感染程度3～4 级能反映溃疡感染的严重性，Wagner 4～5 级与DFU 难愈合及高截肢风险相关[14]。本研究Wagner 4～5 级和感染程度3～4级均是影响DFU 预后不良的危险因素，主要是这些DFU 患者病情较重，疾病进展迅速，截肢和死亡风险增加。DFU 病程长对DFU 患者预后也造成影响，这可能是病程越长，患者溃疡病变越严重，下肢的血运性越差，从而影响DFU 患者的预后。空腹血糖和糖化血红蛋白水平升高也是影响DFU预后的危险因素，这主要是高血糖状态导致的代谢紊乱引起体内血管功能障碍和神经损伤，进而造成足部溃疡和下肢感染。

ROC 曲线显示，Hsa_circ_0080425 ≥1.60 预测DFU 患者预后不良的AUC 均大于CRP 及PCT，其敏感度和特异度均较好。说明Hsa_circ_0080425表达水平检测能有效地预测DFU 患者预后不良，有望作为DFU 预后评估的分子标志物。张懿恋等[15]研究表明，circular RNA 在DFU 中存在异常表达，与DFU 发生发展有关，对预测DFU 病情进展及预后具有较好的价值。

综上所述，DFU 患者Hsa_circ_0080425 表达水平升高与病情严重程度及预后不良有关，是预测DFU 患者预后不良的分子标志物。