血清残余脂蛋白胆固醇定量检测对动脉粥样硬化性心血管疾病诊断的临床价值研究

李才信，马志强，马云珊，黄本林，胡爱萍，王 霖

（1.昆明市第三人民医院/云南省传染性疾病临床医学中心 a.长坡检验科；b.综合内科，昆明 650301；2.曲靖市第二人民医院医学检验科，云南曲靖 655000）

动脉粥样硬化性心血管疾病（atherosclerotic cardiovascular disease，ASCVD）是心脑血管疾病中以动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）为基本病理特点的一系列疾病的总称。关于AS 的发生机制，主流观点有脂源性学说、内皮细胞损伤学说还有免疫和炎症机制等[1-3]。血脂异常是AS 形成的核心因素，低密度脂蛋白-胆固醇（LDL-C）作为“坏胆固醇”，向来被认为是致AS 的罪魁祸首[4]。因此，过去几十年主要集中于降低LDL-C 水平的调脂策略成为ASCVD 预防的基石[5]。然而，部分研究发现将LDL-C 降至推荐浓度后，仍有很高再次发生心血管事件的残留风险[6-8]。目前主流观念将残余脂蛋白胆固醇（residual lipoprotein cholesterol，RLP-C）[9]定义为富含三酰甘油（TG）的胆固醇，由空腹状态下的极低密度脂蛋白-胆固 醇（very low-density lipoproteins-cholesterol，VLDL-C）和中间密度脂蛋白胆固醇（intermediatedensity lipoproteins-cholesterol，IDL-C）以及非空腹状态下的VLDL-C，IDL-C 和乳糜微粒残余物组成。大量研究表明，不管从临床队列研究还是从生物学机制角度，RLP-C 与ASCVD 的残留风险密切相关。既往研究中评估RLP-C 水平采用的方法主要分为两大类：测量法和估算法。测量法主要有免疫分离法[10]、超速离心法[11-12]、酶联免疫吸附法[13]和硫代巴比妥酸反应法[14]等。因操作方便，估算法在队列研究中逐渐得到推广和应用。但是，目前国内外尚无RLP-C 明确定义、标准参考方法和参考物质，缺乏统一的溯源性，这是目前临床应用RLP-C 遇到的最大挑战。本研究除了探索对照人群和ASCVD 患者之间以及外周动脉粥样硬化和冠心病患者之间RLP-C 浓度差异，还对比分析了测定的RLP-C（measured RLP-C，RLP-Cm）、估算的RLP-C（estimated RLP-C，RLP-Ce）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白-胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白-胆固醇（LDL-C）和TG 在诊断外周动脉粥样硬化和冠心病中的灵敏度和特异度，以期为RLP-C 在临床实践中的推广应用提供新的科学依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取2019 年3 月～2020 年1 月在曲靖市第二人民医院心脏内科、糖尿病科和内分泌科就诊的671 例动脉粥样硬化患者为病例组，筛选同时期住院的无动脉粥样硬化的325 例患者为对照人群，两组人群的一般人口学资料见表1。病例组和对照组年龄、性别构成、身高、体重、收缩压和舒张压、吸烟史、高血压史、糖尿病史等一般资料比较差异均有统计学意义（均P＜0.05），体质指数（body mass index，BMI）和肥胖情况差异无统计学意义（均P＞0.05）。纳入标准：①对照人群：经血管超声检查未发现颈部动脉、下肢动脉血管壁内膜中层厚度增厚，未发现斑块形成；冠状动脉造影检查未发现斑块形成以及因其造成的冠脉狭窄；②外周动脉粥样硬化患者：颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉外段及分叉处以及股总动脉、股浅动脉、股深动脉、腘动脉、胫前动脉、胫后动脉和足背动脉。③冠状动脉粥样硬化性心脏病患者：不同于传统冠心病诊断标准[20]，本研究中冠状动脉动脉造影检查发现任意分支冠脉出现粥样斑块或狭窄即可达到冠状动脉粥样硬化诊断标准。排除标准：①年龄＞85岁或＜18 岁；②急性感染或创伤；③存在严重肝肾功能不全、凝血功能障碍；④既往有恶性肿瘤、血液性疾病及精神异常等相关病史；⑤其他原因不能耐受动脉超声检查和冠脉造影检查；⑥信息资料不完善者。本研究获得入选研究对象的知情同意，临床资料收集和数据分析时，对相关信息进行保密处理。

表1 病例组和对照组人群一般人口学资料[M（IQR），n（%）]

动脉粥样硬化诊断标准：动脉内膜完整光滑，且内- 中膜厚度（intima media thickness,IMT）＜1.0mm 为正常；1.2mm ≥IMT ≥1.0mm 为动脉内膜增厚；IMT ≥1.2mm 或为临近部位IMT 值的1.5倍或以上时诊断为粥样斑块形成。

1.2 仪器和试剂 主要仪器为cobas8000 全自动生化分析仪，TC 测定采用胆固醇氧化酶法；TG 测定采用酶比色法；HDL-C，LDL-C 测定采用均相酶比色法；以上检测指标所用试剂均为德国罗氏诊断公司。脂蛋白残粒胆固醇测定试剂盒（酶法）（上海鸿润生物科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 资料收集及血清样品采集：收集所有研究对象的一般临床资料和实验室指标，包括性别、年龄、吸烟史、高血压病史以及血脂、血糖和尿酸等项目。在入院次日清晨空腹状态下抽取病例组和对照组患者静脉血5 ml，离心，收集上清，置于-80℃冰箱中备用。

1.3.2 定量RLP-C 测定：反应原理：①试剂中的表面活性剂和磷脂酶D 协同作用，选择性的修饰残粒样脂蛋白（RLPs），使其溶于反应体系中，形成溶解态的残粒样脂蛋白，同时屏蔽其他脂蛋白不溶于反应体系中。②溶解态的残粒样脂蛋白中的胆固醇酯（RLP-C ester）经胆固醇酯酶水解，形成游离胆固醇。③生成的游离胆固醇在胆固醇氧化酶的作用下，生成胆甾烯酮和双氧水，并经特林德尔（Trinder）反应产生色源显色。整个反应过程中，经表面活性剂、磷脂酶D 和胆固醇酯酶等多种酶的共同作用，将RLPs 以外的其他脂蛋白排除。

结果计算：RLP-C（mg/dl）=（ΔA测定/ΔA标准）×C标准

1.3.3 相关公式：估算法RLP-C（RLP-Ce）= TC-(HDL-C+LDL-C)，non-HDL-C = TC-HDL-C。

1.4 统计学分析 采用SPSS 24，R3.4.2 软件及相关包进行数据整理、统计分析和作图。数据分布特征采用S-W 正态性检验并结合频率分布直方图、Q-Q 图及偏度系数综合判断。正态分布的计量资料以平均值（标准差）[x(s)]表示，组间差异性分析采用独立样本t检验。非正态分布的计量资料以中位数（四分位数间距）[M（IQR）]表示，进行独立样本Wilcoxon秩和检验。计数资料以相对数n（%）表示，组间比较采用χ2检验。绘制受试者工作特征（receiver operator characteristic，ROC）对比分析RLP-Cm，RLP-Ce，TC，HDL-C，LDL-C 和TG在筛查外周动脉粥样硬化和冠心病中的诊断效能。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对照组和病例组实验室检查结果比较 见表2。本研究共纳入996 例受试对象，对照组325例，病例组671 例。与对照组群相比，病例组血小板、血尿酸和血总胆红素水平差异无统计学意义（均P＞0.05），白细胞计数、红细胞分布宽度、LDL-C，HDL-C，血肌酐等项目差异均有统计学意义（均P＜0.05）。

表2 对照组和病例组实验室检查结果比较[M（IQR）,n（%）]

2.2 对照组和病例组RLP-Cm 浓度比较 病例组RLP-Cm浓度高于对照组[10.3（6.4，15.5）mg/dl vs 9.2（6.8，11.9）mg/dl]，差异具有统计学意义（z=-3.200，P＜0.001）。进一步将病例组患者分为外周动脉粥样硬化组和冠心病组。亚组分析结果显示，与对照组相比，外周动脉粥样硬化患者血清RLP-Cm浓度[9.9（5.9，15.9）mg/dl]升高，但差异无统计学意义（z=-1.926，P=0.057），冠心病患者RLP-Cm水平[10.7（6.6，15.4）mg/dl]升高，差异有统计学意义（z=-3.785，P=0.001），冠心病组RLP-Cm浓度较外周动脉粥样硬化组[10.7（6.6，15.4）mg/dl]升高，差异无统计学意义（z=-0.624，P=0.416）。

2.3 RLP-Cm对ASCVD 发生的诊断价值 ROC曲线分析结果显示，RLP-Cm截断值为11.75mg/dl，诊断外周动脉粥样硬化的灵敏度和特异度分别为59.8%和76.6%，ROC 曲线下面积（AUC）为0.686（95%CI：0.653～0.720，P＜0.05），见图1。RLP-Cm截断值为12.70mg/dl，诊断冠心病的灵敏度和特异度分别为58.4%和76.0%，AUC 为0.711（95%CI：0.653-0.720，P＜0.05），见图2。血脂单项指标筛查外周动脉粥样硬化和冠心病时，RLP-Cm的诊断效能优于RLP-Ce，LDL-C，TC 和TG，见表3 和表4。

图1 血清RLP-Cm 诊断外周动脉粥样硬化的ROC 曲线

图2 血清RLP-Cm 诊断冠心病的ROC 曲线

表3 血脂指标对外周动脉粥样硬化发生的诊断价值

表4 血脂指标对冠心病发生的诊断价值

3 讨论

长期以来以降LDL-C 为主的调脂策略在降低ASCVD 的发病风险方面显现了不错的效果。将LDL-C 降得越低，心血管净获益越大[15-16]。作为脂蛋白代谢中的重要部分，升高的血清RLP-C 能解释ASCVD 患者降LDL-C 治疗达标情况下再次发生心血管意外的残留风险[17]。丹麦哥本哈根大学的VARBO 教授等[18]发现，独立于降低的HDL-C，非空腹RLP-C 浓度增加1mmol/L（39mg/dl），相应的IHD 的发病风险上升2.8 倍。最新研究还发现[19]，既往诊断为心肌梗死的患者，血清RLP-C 每降低0.8mmol/L（32mg/dl），二级预防中再次出现心血管事件的风险降低20%。

通过分析671 例ASCVD 患者和325 例对照人群血清中RLP-Cm 水平差异，初步探索利用RLPCm筛查ASCVD 的临床价值。对照人群血清RLPCm浓度明显低于ASCVD 患者，进一步将ASCVD患者分为外周动脉粥样硬化组和冠心病组，发现两组RLP-Cm差异无统计学意义。对于一个筛查性血清指标而言，找到区分正常人群和患病者的切点尤为重要。本研究中，RLP-Cm筛查外周动脉粥样硬化和筛查冠心病，具有较好的特异度，灵敏度不是特别满意，但总体诊断效能优于RLP-Ce，TC，TG 和LDL-C。就本研究的结果推测，利用RLPCm作为ASCVD 的筛查指标，具有一定临床指导价值。当然，血脂代谢异常相关指标主要在提示疾病的危险因素并促使受检对象采取有效预防措施方面发挥重要临床价值。从发病机制来说，RLP-C 比LDL-C 颗粒大，既往人们认为其对动脉壁的渗透仅通过物理吸附。然而，载脂蛋白B100 和ApoB48均可从AS 斑块中提取到[20]，这说明比LDL-C 颗粒大的脂质也有可能穿透动脉内膜。后续实验证据表明RLP-C 可以进入动脉内膜，导致AS，而乳糜微粒及其残留物无法穿透内皮层。巨噬细胞通过识别RLP-C 表面的ApoE 触发脂蛋白摄取，故RLP-C不需要氧化修饰就能被巨噬细胞摄取[21-22]。此外，炎症介导了AS 的发生发展，VERBO 等[23]研究发现RLP-C 的增加与低度炎症和IHD 有因果关系，而LDL-C 与此无关。杨莉婷等[24]的研究也发现RLP-C 与超敏C 反应蛋白密切相关。这些都表明，不同于LDL-C，RLP-C 是通过驱动炎症组分导致AS。在临床观察性研究中，高浓度的RLP-C 比TG 和LDL-C 在预测易损斑块的发生上具有更高价值[25]。针对LDL-C 水平进行干预和治疗的同时，额外地监测RLP-C 水平，有助于评估心血管残余风险，对预防心血管事件发生具有意义。我们在接下来的研究中，对入组对象进行了随访跟踪，进一步明确了RLP-Cm水平升高与ASCVD 患者预后的关系，目前尚未正式报告研究结果。

由于其代谢特点，RLP-C 检测方法的探索经历了漫长而艰辛的过程。本研究是国内为数不多的采用全自动生化分析仪定量检测血清RLP-C 的研究，使用酶法检测血清RLP-C，结果显示检测系统性能良好，结果稳定可靠[26]，可用于临床实践。方程估算法因方便、直观、价格低廉等优点，在临床工作和实验研究中得到青睐，但相对而言，定量测定法如超速离心VAP 法、核磁共振光谱学、直接自动化分析等测量方法可能更准确可靠。本课题组既往的研究[27]显示，相对于定量测定法，估算法的平均阳性偏倚为0.2mmol/L[95%CI（0.18～0.23）]。目前国内仅在局部地区进行调查研究，康晓涛等[28]对60 例苏州非冠心病人进行研究，得出RLP-C 均值为0.4mmol/L，这与本研究中健康人群RLP-Cm中位数9.2mg/dl（0.24mmol/L）存在差异。欧洲动脉粥样硬化学会和欧洲临床化学与检验医学联合会联合声明共识[29]RLP-C 的临界值为0.9mmol/L，而本研究中筛查ASCVD 的临界值为11.75mg/dl（0.3mmol/L）。国内外得出的结论有所差别，考虑人种、饮食、生活习惯等差别所致可能性大，因此，建立适宜我国人群特点的参考区间作为临床工作和研究的指导范围非常重要。此外，国内外仍没有定量检测RLP-C 的参考方法，各实验室的结果没有可比性。RLP-C 估算法不能完美替代定量检测法，我们急需制定RLP-C 的标准定义和测量参考方法。

本研究也存在诸多缺点和不足，如样本量不够大，仅为观察性研究，入选对象大多限于云南省内，没有排除既往进行过降脂治疗的对象等因素，可能对所得结论产生一定影响。

综上所述，ASCVD 患者血清RLP-Cm 水平较对照人群明显升高，选择RLP-Cm作为筛查ASCVD患者的指标，总体诊断效能优于RLP-Ce，LDL-C，TC 和TG，具有十分重要的临床应用价值。为了减缓我国ASCVD 近年剧增的严峻形势，未来ASCVD一级预防和二级预防策略或许应给予RLP-C 足够的重视。