西双版纳黄瓜种质的改良

孙宇红 谢翌帆 秦培超 普文才 何欢乐* 张慧婷

（1 上海市闵行区三农综合服务中心，上海 201109；2 上海交通大学农业与生物学院，上海 200240；3纳板河流域国家级自然保护区管理局，景洪 666100） *为通信作者

黄瓜(Cucumis sativusL.)是我国重要的蔬菜作物之一，以设施栽培为主，可周年供应，经济效益高，且果实脆嫩爽口，深受大众喜欢。但是，黄瓜的遗传背景相对较窄，不利于品种改良，故挖掘和利用各类种质资源，引入更多的优异基因，成为了当前黄瓜育种的趋势之一。

黄瓜起源于喜马拉雅山南麓，我国的西双版纳地区是黄瓜的起源地之一[1]。西双版纳黄瓜（C.sativusL.var.xishuangbannanesis）是在长期地理隔离和交流受限等条件下形成的特殊种质群体，与其他黄瓜材料的遗传距离相对较远，属于半野生材料，具有长势强、抗性强、果实外形粗大、单瓜质量为2～3 kg、老瓜果肉和胎座均呈橙黄色、果肉富含β-胡萝卜素、果实耐贮藏等特性[2-5]。但是，随着黄瓜商业品种在云南省的大量种植和上市，当地的西双版纳黄瓜品种受到了很大冲击。目前，西双版纳黄瓜品种以农家零星种植为主，栽培面积逐年减少，亟需对其进行足够的保护和利用，以发挥其资源潜力。同时，由于长期适应云南西双版纳地区的短日照条件，西双版纳黄瓜品种在长日照地区种植普遍表现为晚开花[6-8]、生长周期长、主蔓雌花率较低、白粉病抗性不够理想等，不利于直接将其应用于育种，需要先对其进行相应的遗传改良，再进行应用。鉴于此，笔者对西双版纳黄瓜进行了种质改良，即将西双版纳黄瓜农家种与欧洲温室型自交系进行杂交，然后将西双版纳黄瓜农家种作为轮回亲本，回交3 代，同时利用黄瓜白粉病抗性基因与全雌基因F的连锁标记进行辅助选择，以期获得早花、全雌、抗白粉病的西双版纳黄瓜自交系，从而为黄瓜抗白粉病品种的选育与西双版纳黄瓜农家种的有效利用奠定基础。现将相关改良情况报道如下。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试黄瓜品种包括欧洲温室型自交系SA0422、西双版纳黄瓜农家种BN5-1 和BN38。其中，SA0422的抗白粉病等级为抗病，具有白粉病抗性基因pm5.1和PM5.2，开花习性为早花、全雌，雌花率为100%；BN5-1 和BN38 的抗白粉病等级均为中间类型，开花习性为晚花，雌花率低，老熟瓜果肉心腔颜色为橙黄色，5心皮。另外，以白粉病抗性测定为感病的华北型自交系9930作为对照品种。黄瓜材料均种植在上海交通大学农业与生物学院的温室中，采用悬吊式、基质滴灌栽培，统一水肥管理。

1.2 种质改良方法

1.2.1 黄瓜遗传改良方案

将西双版纳黄瓜农家种BN5-1 和BN38 分别与欧洲温室型自交系SA0422（供体亲本）进行杂交，然后用轮回亲本BN5-1 和BN38 各回交3 代，最后自交获得纯合株BN5-1R 和BN38R，回交和自交后代植株利用白粉病抗性基因（pm5.1和PM5.2）与全雌基因F的连锁标记进行辅助选择（Markerassisted selection，MAS）。在回交后代MAS 的前景选择中，挑选出含供体亲本条带的植株定植于田间。早花性状为显性，可通过田间早花表型选择后代植株。在改良后代自交系鉴定中，每个自交系材料分别种植10 株，重复3 次，随机区组设计。

1.2.2 白粉病抗性鉴定

在黄瓜成株期（植株具有15～20张叶片），调查植株最下方的5～6张真叶的白粉病发生情况，并记录发病等级（分为5个等级）[9-10]。其中，发病等级小于1.5 时，记为抗白粉病（R）；发病等级大于等于1.5、小于3.0 时，记为中间类型（M）；发病等级大于等于3.0 时，记为感白粉病（S）。

1.2.3 田间始花时间和雌花率调查

始花时间的调查：记录每株材料主蔓上第一朵花的开放时间。

雌花率调查：记录黄瓜植株主蔓上每个节位的开花类型，雌花率为主蔓前20节上着生雌花节位数的百分比。

1.2.4 分子标记辅助选择

在黄瓜植株苗期，采集1/4 片子叶，采用改良CTAB 法[11]提取基因组DNA，并利用目标基因连锁标记进行MAS，然后从回交群体中筛选出含供体亲本带型的植株定植于温室，用于后续的田间选择和回交等。目标基因具体为：（1）白粉病抗性基因pm5.1。选择黄瓜抗白粉病基因pm5.1的InDel 标记InDel-MLO 1，其正向引物为5'- G C TA TT TG C TG TT C TCTTCATCCT-3'，反向引物为5'- TCATATT G T G A A C T T A C C C C A T T G-3' 。P C R 和电泳检测参照相关文献[9-10]。（2）白粉病抗性基因PM5.2。利用PM5.2紧密连锁标记S-InDel-98 进行该抗性基因的MAS。标记S-InDel-98 与PM5.2 基因的物理距离小于20 kb，其正向引物为5'-TGAATATT T G T G T T A T G T G T G G G-3' ，反向引物为5'-T G A A A T T G A G A A T G G A A G G G-3' 。（3）全雌基因F。黄瓜全雌基因F（CsACS1G）的共分离标记参照Mibus 等[12]的方法，其正向引物为5'-TTAAC T AC TT C GG A CG GG C AT A G-3'，反向引物为5'-A G G T G T T C A G C A A A C A T A G G G T G-3' 。

1.3 数据处理与分析

采用Excel软件对试验数据进行处理和统计性分析，采用SPSS 17.0 软件进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 黄瓜回交后代植株的分子标记辅助选择

在回交转育改良西双版纳黄瓜农家种过程中，在苗期进行MAS，即利用目标性状（抗白粉病和全雌）的连锁标记选择回交后代植株，挑选出含有目标区段的小苗20～30 株，定植于温室，再通过田间早花表型选择后代植株，继续回交或自交留种。

在pm5.1基因的MAS 中，琼脂糖凝胶电泳结果显示，InDel-MLO1 标记可显著区分白粉病抗性为中间类型的亲本BN5-1 和抗病亲本SA0422，F1包含两个亲本的带型，由于此抗病基因为隐性遗传，故杂合带型个体对应为感病植株，这与聂京涛等[9]的结果一致。最终，从回交群体中选出含pm5.1基因的杂合个体，或从F2 群体中选出含pm5.1基因的纯合个体。见图1。

图1 抗白粉病基因pm5.1 共分离标记InDel-MLO1筛选黄瓜回交群体的电泳结果

利用PM5.2紧密连锁标记S-InDel-98 筛选出黄瓜回交后代植株，挑出含供体亲本带型的后代植株，其白粉病抗性与预期相符。见图2。

图2 抗白粉病基因PM5.2 连锁标记S-InDel-98筛选黄瓜回交群体的电泳结果

由图3 可知，利用全雌基因F的标记进行MAS，基因型为ff的西双版纳黄瓜植株不含CsACS1G基因，没有该标记的PCR 扩增带，故利用全雌基因F的标记可以在苗期快速筛选出具有全雌基因F的后代植株。

图3 全雌基因F 共分离标记筛选黄瓜回交群体的电泳结果

2.2 西双版纳黄瓜改良后代的表型分析

通过杂交和回交，将目标性状基因导入西双版纳黄瓜农家种BN5-1 和BN38 中，经过3 次回交，然后自交1～2 代，同时结合MAS 和田间表型选择，最后获得目标基因纯合株系BN5-1R 和BN38R。将其后代植株种植于田间，进行相应的表型鉴定，进一步确认目标性状的改良情况。

由表1可知，对照材料9930的平均白粉病病级最高，其抗病性显著低于其他自交系，感病程度与预期一致；西双版纳黄瓜农家种BN5-1 和BN38均为中间类型，对白粉病具有一定的抗性，病级显著低于9930，两材料之间的白粉病病级差异不显著；SA0422 的平均病级为0，表现为高抗白粉病；回交转育含白粉病抗性基因的西双版纳黄瓜自交系BN5-1R 和BN38R 的平均病级与SA0422 相近，即为抗白粉病，这3个自交系间的白粉病病级差异不显著。由此表明，种质改良成功导入了2个白粉病抗性基因，提高了西双版纳黄瓜农家种的白粉病抗性。

表1 黄瓜田间性状的调查情况

由表1 可知，SA0422 的始花时间约为30 d，显著低于其他材料；而BN5-1 和BN38 的始花时间较长，约58 d，2个材料间的始花时间差异不显著；改良后代BN5-1R 和BN38R 的始花时间大幅度降低，约32 d，接近于亲本SA0422。在植株雌花率方面，SA0422 为全雌，雌花率约为100%，显著高于其他材料；而BN5-1 和BN38 雌花率均较低，在主蔓的前20节上没有出现雌花，与沈镝等[13]的研究结果一致；遗传改良后代BN5-1R 和BN38R 的雌花率大幅度提高，有些植株前面几节无花芽，但植株产生的花芽均为雌花，即实际雌花率达100%，这与植株的F纯合基因型相符。

综上，通过杂交和回交，成功地将4个目标性状基因导入西双版纳黄瓜中，获得了早花、全雌型、抗白粉病的改良株系，且保持了原材料果肉橙黄色、黄瓜味浓厚的特性，这为西双版纳黄瓜资源的广泛应用打下了基础。

3 结论与讨论

在黄瓜生产上，白粉病的发生非常普遍，应用抗病品种是防治该病害的主要策略之一。黄瓜白粉病抗性基因pm5.1为隐性抗病基因，在常规育种中回交转育时无法根据回交当代的表型选择后代，需要通过自交后的抗性鉴定确认抗性基因，但育种周期长、效率低、费时费力，而利用隐性基因的连锁标记辅助育种可以突破该瓶颈。本研究对西双版纳黄瓜农家种的改良，充分体现了MAS 的优势，在苗期即可进行大规模筛选，不需要进行抗病接种鉴定，且选种准确，节约了大量的田间栽培时间和管理投入。同时，本研究对西双版纳黄瓜农家种的白粉病抗性的遗传改良结果，也再次验证了pm5.1和PM5.2是黄瓜主要的白粉病抗性基因，这两个基因均是抗白粉病表型所必需的，且本研究进一步确认了抗白粉病基因型为pm5.1 pm5.1/PM5.2，其他基因型的植株叶片均会产生白粉病斑，白粉病抗性低于供体亲本（pm5.1 pm5.1/PM5.2 PM5.2）。

对于黄瓜白粉病抗性和全雌性状的MAS，前期的研究基础很关键。黄瓜全雌基因F、白粉病抗性基因pm5.1和PM5.2已经克隆，而且这几个基因在供试的西双版纳黄瓜材料中的基因型也已经过相应的测序确认，均为pm5.1 pm 5.1/PM5.2 PM 5.2/ff。根据亲本间的基因组DNA 序列差异，容易开发出更合适的标记用于MAS。这些先决条件促进了相应连锁标记的开发和应用，保障了MAS 的成功。

已有研究显示，黄瓜早花性状受多个基因调控，主要与FLOWERING LOCUS T(FT)及其周边序列差异密切相关[6-8]。由于本研究尚未确认供试亲本在早花基因上的差异，没有开发和应用相应的连锁标记，这在一定程度上增加了回交转育过程中的田间工作量。

在表型分析时，遗传改良自交系B N 5-1 R 和BN38R 的始花时间和雌花节数接近供体亲本，但仍存在细微差异；同时，植株前1～2节的花芽生长迟缓，这可能是受其他微效基因的影响，也有待进一步的研究。

在田间，未改良的西双版纳黄瓜植株叶片有白粉病斑发生，但病斑的扩展速度较慢，植株整体呈现耐病表型，而遗传改良自交系BN5-1R 和BN38R均呈现很高的白粉病抗性，且同时具有欧洲温室型黄瓜的早花、全雌性状，这为黄瓜抗白粉病品种的选育与西双版纳黄瓜农家种的有效利用提供了极大的便利。