‘三友金香’七宝十条筋黄金瓜新品种亲本组织培养提纯复壮技术

邢博闻 赵晟晨 汤桂钧 胡海峰 姜亮 赵韵 王能 殷丽青

（1 上海市闵行区农产品质量安全中心，上海 201109；2 上海三友种苗有限公司，上海 201617；3 上海市闵行区农业技术服务中心，上海 201199；4 上海市闵行区三农综合服务中心，上海 201109；5上海市农业科学院林木果树研究所，上海 201403） *为通信作者

七宝十条筋黄金瓜是上海市四大名瓜之一，距今已有100 多年的栽培历史，深受广大市民青睐，2019年被列为农产品地理标志产品。‘三友金香’是由上海三友种苗有限公司于近年通过杂交配组选育而成的七宝十条筋黄金瓜新品种（F1代组合），2017年12月注册登记为国家农业农村部非主要农作物新品种[编号：GPD甜瓜（2017）310036][1]。2018年开始，‘三友金香’作为可替代老七宝十条筋黄金瓜的新品种，在长三角地区被广泛推广应用。

甜瓜为异花授粉作物，常受昆虫、风力等外界自然因素的影响而产生天然杂交，致使品种的优良遗传性状发生退化与变异。为保证其种性长期不发生混杂和退化，生产单位常采用人工单株（单瓜）选择的方法进行提纯复壮，以获得纯合一致的种子。鉴于七宝十条筋黄金瓜是异花授粉作物，采用人工单株（单瓜）选择的方法进行提纯复壮，其效果甚微，更无法脱病毒。而应用组织培养技术，特别是茎尖离体培养方法，不仅可有效解决品种退化和自然杂交混杂的问题，还具有工厂化快繁、脱病毒的优势。例如，广泛采用茎尖脱毒方法，可在无菌条件下培养获得脱毒植株[2]。在此背景下，为了使‘三友金香’七宝十条筋黄金瓜新品种优良种性不退化及保持杂交双亲的高度纯合，笔者进行了‘三友金香’七宝十条筋黄金瓜新品种亲本组织培养提纯复壮技术研究，主要通过应用茎尖离体培养方法，对其杂交双亲（编号为M2014-09 虎皮斑金黄十条筋和M2014-18 橙黄斑金黄十条筋）进行提纯复壮，最终育出了优质试管苗，经鉴定纯度达99%以上。现将相关研究结果报道如下，以期为‘三友金香’七宝十条筋黄金瓜新品种的推广应用奠定基础。

1 外植体发生培养

1.1 杂交双亲来源

在原七宝十条筋黄金瓜的原始群体中，通过多年多代自交、回交，选育获得高纯度的亲本材料。其中，以M2014-09 虎皮斑金黄十条筋黄金瓜为母本，M2014-18 橙黄斑金黄十条筋黄金瓜为父本。

1.2 外植体取材

2个亲本于3月上旬在上海三友种苗有限公司位于闵行区浦江镇育种基地的塑料大棚内进行育苗；4月中旬进行移栽；5 月上旬、主蔓4 叶1 心时进行摘心，不久主蔓即抽生2～3根子蔓；待到5月中下旬、子蔓长至5 叶以上时，剪取长度约4 cm 的子蔓顶端作为外植体，存放于塑料瓶中，并拧紧瓶盖，以防其失水萎蔫。

1.3 外植体的清洗与消毒

将剪取的子蔓顶端用洗洁精清洗3遍后，用干净纱布包裹，然后置于水龙头下用自来水冲洗2 h。然后，在超净工作台上将上述材料用3步法进行消毒：第1 步，用75%酒精消毒1 min，无菌水冲洗1 遍；第2 步，用1∶50 的洁尔敏消毒15 min，无菌水冲洗1 遍；第3 步，用12%次氯酸钠消毒10 min，无菌水冲洗3 遍，最后用无菌滤纸吸干材料备用。

1.4 茎尖的剥取与接种

因甜瓜属双子叶植物，与大部分单子叶植物相比，其茎尖不是特别明显，故需在超净工作台上借助80 倍解剖镜用解剖针、手术刀小心剥取茎尖，长度掌握在0.5～1.0 mm；切取茎尖以下0.5 cm 长度的顶端，接种于发生培养基上，每瓶接种1 个茎尖，以诱导茎尖生长，使其成为无菌系的“丛生芽”。

1.5 发生培养

发生培养基配方以MS+BA 1.0 mg/L+KT 0.5 mg/L+IBA 0.1 mg/L（另加琼脂粉5 g/L、蔗糖30 g/L，调节pH 至5.8 左右）较为适宜，培养室温度为24 ℃、24 h 恒温，光照时间为12 h/d（7:00—19:00），光照强度为3 000 lx 左右（采用LED 光源），光照与温度实行自动调节控制，最终茎尖发生成功率可达98%，且茎尖生长早而快。

2 无菌系的继代增殖培养

2.1 继代增殖培养基配方

继代增殖培养基配方以MS+BA 1.0 mg/L+KT 0.5 mg/L+IBA 0.1 mg/L（另加琼脂粉5 g/L、蔗糖30 g/L，调节pH 至5.8 左右）较为适宜，在25 d 增殖1 次的情况下，增殖系数可保持在1∶3.0～4.5的合理区间内，且瓶苗生长健壮，无“玻璃苗”产生。

2.2 培养周期

继代增殖培养的培养周期以25 d左右为宜，在此培养周期内，瓶苗叶色正常，丛生芽生长较多，枝条直立挺拔。当培养周期超过25 d（尤其是超过30 d）时，瓶苗生长变差，叶色褪淡甚至发黄，部分枝条细长扭曲，达不到壮苗的标准。

2.3 培养室条件

继代增殖培养的培养室温度为25 ℃、24 h 恒温，光照时间为12 h/d（7:00—19:00），光照强度为3 500 lx 左右（采用LED 光源），光照与温度实行自动调节控制。值得注意的是，在继代增殖培养中，需掌握好培养室的光照强度。当光照强度在3 000 lx 以上时，瓶苗生长良好；当光照强度低于3 000 lx时，瓶苗表现不佳，甚至会出现较多的“玻璃苗”，这可能与七宝黄金瓜喜光、喜温的生物学特性有关。

3 无菌系的生根培养

3.1 生根培养方法

当继代增殖培养的瓶苗长至高3 cm 左右、无“玻璃苗”产生时，即可进行生根培养，从而培育成完整的“试管苗”。具体方法为：将瓶苗中的“丛生芽”切成单株（因节间处富含生长素类物质，容易生根，故切割时要切在节间处），接种至生根培养基上诱导生根。当生根苗根系长度达1 cm左右时，即可将瓶苗移出培养室，置于常规室温、自然光照条件下培养24 h，使其适应外界气候环境。

3.2 生根培养基配方

生根培养基配方以1/2MS+IBA 0.2 mg/L（另加琼脂粉5 g/L、蔗糖20 g/L、铁钠盐38.23 mg/L，调节pH 至5.8 左右）较为适宜，培养3 周后，其生根率可达99%以上，有时可达100%，且根系为白色、较发达，每株有5～6条根（多的可达10余条根）。值得注意的是，为利于试管苗炼苗驯化及提高成活率，不宜采用NAA 作为生根诱导剂，这是因为采用NAA 作生根诱导剂的瓶苗生根状况不如采用IBA作生根诱导剂，表现为瓶苗根少、粗短，且会在根基部着生愈伤组织，而当生根培养苗基部产生愈伤组织后，会导致其生根数减少甚至不生根[3]。

3.3 生根培养室管理

生根培养的培养室温度为24～25 ℃、24 h 恒温，当90%以上幼苗开始生根、根系长度为0.3 mm时，将培养室温度调至22～23 ℃，以使根系粗壮饱满，同时可防止因温度过高而使叶片蒸腾黄化；光照时间为12 h/d（7:00—19:00），光照强度为3 000～3 500 lx。

4 试管苗的炼苗驯化

4.1 试管苗清洗

用镊子将生根并适应24 h的试管苗轻轻取出培养瓶，于清水中漂尽根部琼脂。此阶段叶片较脆嫩，操作时需注意不要伤及叶片。

4.2 炼苗基质

炼苗基质以泥炭∶椰糠∶珍珠岩=2∶1∶1（质量比）为好，基质在充分拌和后喷一些清水，以使基质保持湿润。

4.3 试管苗移栽

穴盘育苗法是目前国内外广泛应用的育苗技术，尤其在组培育苗中应用较多[4]，故试管苗同样采用穴盘育苗法进行炼苗驯化。试管苗的移栽时间以2 月下旬—4月下旬为宜，具体操作为：先将充分拌和的基质装入72孔的硬质塑料穴盘，然后将穴盘置于苗床上；用镊子或竹片将试管苗笔直浅栽入穴盘基质，栽后立即浇足活棵水；移栽后在苗床上方搭好塑料小环棚，如遇晴热天气，需用75%遮光率的黑色遮阳网覆盖，以防幼苗失水萎蔫。

4.4 炼苗期管理

4.4.1 叶面喷雾补水

鉴于2个亲本的试管苗叶片相对较大，但叶片较薄，极易失水萎蔫，故需在移栽后第2天进行叶面喷雾补水。若苗床上方有喷淋装置，则每天叶面喷雾3～5次，每次喷雾20 s（视天气情况灵活掌握喷雾次数，阴天喷雾补水1～2次，晴天则相应增加喷雾补水次数）；若无喷淋装置，可用喷雾器进行叶面喷雾补水。

4.4.2 掌握好适宜的棚内温度

上海地区春季天气多变，棚内温度忽高忽低，对幼苗生长十分不利，因此应根据天气变化情况，因地制宜地采取应对措施，保障棚内温度适宜（棚内温度以24～28 ℃为好，最高不超过30 ℃），以确保幼苗正常生长。

4.4.3 适时追肥

待幼苗长出新根和新叶后，应适时追施速效化肥，以0.5%尿素或三元复合肥（N∶P∶K=15∶15∶15，质量分数）兑水浇灌为好，每月追肥2次，以促进幼苗正常生长。

4.5 穴盘苗适时移栽

当穴盘苗长至高度8 cm以上并具5张以上叶片时，即可将穴盘苗拔出，连带基质一起移栽至育苗大棚内。