温度对红色红曲菌M7液态发酵产monascin和ankaflavin的影响

徐勇,邱子娅,陈莎,2,张佳兰,高梦祥,2,李利,2

(1.长江大学 生命科学学院,湖北 荆州 434025;2.长江大学 食品研究院,湖北 荆州 434025;3.长江大学 动物科学学院,湖北 荆州 434025)

红曲色素是红曲菌(Monascusspp.)发酵产生的天然食用色素,从颜色上分为红色素(λmax=490～530 nm)、橙色素(λmax=460～480 nm)和黄色素(λmax=330～450 nm)3大类[1-2].目前,国内外大规模发酵生产的仅有红曲红色素,可直接或改性后作为食品着色剂,用于腊肉制品、熟肉制品、调制乳、果酱、糖果、糕点等食品中,而红曲橙色素和黄色素这2类天然色素,产量偏低,尚未实现工业化生产[3-4].

目前已报道的红曲黄色素至少包括49种不同结构的化合物,根据溶解性分为醇溶性和水溶性2类,其中红曲素(monascin, MS)和红曲黄素(ankaflavin, AF)是最为常见的2种醇溶性红曲黄色素组分[1,5-6].MS和AF色泽鲜亮醒目,具有较好的pH稳定性、光稳定性和热稳定性[7],是一种优良的微生物来源的天然黄色素.近年来,MS和AF的生物活性成为红曲色素的研究热点,被报道的生物活性包括抗炎、抗氧化、抗糖尿病、抗肿瘤、降血压、调节脂质代谢、调节免疫功能、预防阿尔茨海默症等[5-6,8-10].由此可见,MS和AF不仅在食品着色方面极具开发价值,而且在保健食品和医药领域也具有很好的应用前景.

选育红曲黄色素高产菌株和优化发酵条件是提高红曲黄色素产量的有效手段[6,11-16].但红曲黄色素种类较多,成分复杂,而且缺少商品化的标准品[3],所以相关研究很少对发酵产生的红曲黄色素组分分别进行定性和定量分析,大多根据410 nm(黄色素的特征吸收峰)的吸光值来测定黄色素的色价.因而,对于发酵过程中不同红曲黄色素组分的影响因素和变化规律,目前还缺乏系统性认识.

温度是影响微生物生长和代谢的重要环境因素.红曲菌是一种典型的中温型丝状真菌,其培养与发酵多采用25～30 ℃[17].然而,随着发酵菌株和发酵条件的不同,所产生的红曲色素组分存在差异,最佳发酵温度会发生变化.在水溶性红曲黄色素方面,Huang等[18]研究发现,温度对红色红曲菌(M.ruber)CGMCC 10910液态发酵产生的4种水溶性红曲黄色素组分有不同的影响,其中只有1种水溶性黄色素组分的最佳发酵温度为30 ℃,而其他3种的最佳发酵温度均较高,为35 ℃.在醇溶性红曲黄色素方面,Yongsmith等[11]发现,40 ℃条件下紫色红曲菌(M.purpureus)LPB 97固态发酵产生的醇溶性红曲黄色素的色价显著高于30 ℃,而况嘉铀等[12]发现,红曲菌GN液态发酵产生的醇溶性红曲黄色素的色价随着温度的升高先升高后降低,最佳温度与Yongsmith等[11]的报道差异较大,为22.5 ℃.可见,降低或提高发酵温度,能促进某些红曲黄色素组分的生物合成.目前,温度对MS和AF液态发酵的影响鲜见报道.本研究以红色红曲菌M7为实验菌株,利用紫外-可见吸收光谱法、高效液相色谱法(HPLC)和液相色谱-质谱联用(LC-MS)等方法,研究温度对MS和AF液态发酵的影响,并从红曲色素生物合成途径中关键酶基因表达水平的变化探讨其机制,为提高MS和AF液态发酵产量提供参考.

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

红色红曲菌(M.ruber)M7：华中农业大学农业微生物国家重点实验保藏中心(Culture Collection of State Key Laboratory of Agricultural Microbiology)保藏,编号为CCAM070120.

葡萄糖、NaNO3、K2HPO4、KH2PO4、KCl、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、(NH4)2SO4、CaCl2、蔗糖、甲酸、无水乙醇：分析纯,国药集团化学试剂有限公司;酵母膏、蛋白胨、琼脂：生化试剂,北京奥博星生物技术有限责任公司;乙腈：色谱纯,美国天地有限公司;总RNA提取试剂盒(Trizol法)、反转录试剂盒(HiScript II Q RT SuperMix)、实时荧光定量PCR(qPCR)试剂盒(ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix)： 南京诺唯赞生物科技股份有限公司;红曲素(MS)、红曲黄素(AF)、红曲红素(monascorubrin, MR)：上海源叶生物科技有限公司;红斑素(rubropunctatin, RP)：美国MCE生物科技公司.

孢子培养基[19]：NaNO33 g、K2HPO41 g、KCl 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、酵母膏5 g、蔗糖 30 g、琼脂 15 g,加蒸馏水至1 L.用于红色红曲菌M7孢子的培养.

种子培养基[18]：葡萄糖20 g、酵母膏3 g、蛋白胨10 g、KH2PO44 g、KCl 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.01 g,加蒸馏水至1 L.用于红曲色素液态发酵种子的培养.

发酵培养基[18]：葡萄糖50 g、(NH4)2SO45 g、KH2PO45 g、CaCl20.1 g、FeSO4·7H2O 0.01 g,加蒸馏水至1 L.用于红曲色素的液态发酵.

培养基灭菌条件为121 ℃,20 min.

1.2 主要仪器与设备

PB-10 pH计(德国赛多利斯有限公司);SPX-250B-Z生化培养箱(上海博迅实业有限公司医疗设备厂);HFsafe-1200生物安全柜(上海力申科学仪器有限公司);IS-RDS3恒温摇床(美国精骐有限公司);Beckman Allegra X-30R离心机(德国贝克曼公司);HVE-50高压灭菌锅(日本株式会社平山制作所);鼓风干燥箱(上海新苗医疗器械制造有限公司);TU1900紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司);LC1200高效液相色谱仪(美国Agilent公司);TripleTOF 5600液相色谱-质谱联用仪(美国 AB Sciex公司);S1000梯度PCR仪、CFX96 Touch荧光定量PCR仪(美国Bio-Rad公司).

1.3 实验方法

1.3.1 红曲菌的液态发酵

红色红曲菌M7的活化和孢子制备参照Li等[19]的方法,将新鲜制备的105/mL的孢子悬液,以1%(体积分数)的接种量接入种子培养基中,30 ℃,180 r/min振荡培养2 d,再以4%(体积分数)的量接种到发酵培养基中,于不同温度(25、30、35、40 ℃)下,180 r/min振荡培养7 d.

1.3.2 红曲色素的提取

由于在液态发酵过程中,醇溶性红曲色素除了存在于菌丝体细胞内,还能分泌至发酵液中结晶形成色素小颗粒[20].因此,为了提取胞内、胞外总醇溶性红曲色素,选用快速滤纸对发酵液进行真空抽滤,收集菌丝体和胞外色素晶体的混合物[20],用3倍发酵液体积的蒸馏水洗涤后,将菌丝体、胞外色素晶体和附着大量色素晶体的滤纸一起放入与发酵液等体积的体积分数为70%的乙醇溶液(pH=2.0)中,30 ℃,200 r/min振荡条件下避光浸提1 h,再次真空抽滤,得到的滤液即为红曲色素提取液,收集的菌丝于80 ℃烘箱干燥至质量恒定后用于测定生物量.

1.3.3 红曲色素的紫外-可见吸收光谱分析

红曲色素提取液用体积分数为70%的乙醇溶液(pH=2.0)稀释一定倍数,以1 nm的间隔在350～550 nm进行光谱扫描.红色素、橙色素和黄色素的色价分别用510、470、410 nm处的吸光度A计算[21],三者之和为总色价,代表红曲色素总产量[22].色价/(U·mL-1)=A×稀释倍数.

1.3.4 红曲色素的HPLC分析

红曲色素提取液用体积分数为70%的乙醇溶液(pH=2.0)稀释一定倍数,进样10 μL进行HPLC分析.色谱柱：Inertsil ODS-3(250 mm × 4.6 mm,5 μm);柱温：30 ℃;二极管阵列检测器(DAD)检测波长：210～600 nm,其中黄色素、橙色素和红色素组分的监测波长分别为390、470、520 nm.流动相A相为乙腈,B相为酸水(pH 3,甲酸调节),C相为去离子水,流速为 0.8 mL/min.梯度洗脱条件见表1.根据峰面积和标准曲线对各红曲色素组分的含量进行定量.

表1 HPLC梯度洗脱条件

1.3.5 红曲色素的LC-MS分析

样品处理同1.3.4.色谱柱：Kinetex 2.6 μm F5(100 mm × 2.1 mm);柱温：30 ℃;流动相：A相为酸水(含体积分数0.1%甲酸),B相为乙腈;梯度洗脱条件：0～1 min,95%(体积分数,下同)A;1～8 min,95% A～15% A;8～9 min,15% A;9～9.1 min,15% A～95% A;9.1～11 min,95% A;流速：0.2 mL/min;进样量：10 μL;DAD检测波长：210～600 nm;离子源：电喷雾电离(ESI),正离子模式;扫描范围：质荷比(m/z) 100～1 000;电喷雾电压：5 500 V;离子源温度：550 ℃;雾化气压力379 kPa;辅助气压力379 kPa;气帘气压力172 kPa.

1.3.6 qPCR分析

在红色红曲菌M7液态发酵过程中,分别于第3、5、7天收集菌丝体,液氮速冻后-80 ℃保存.采用Triozol法提取菌丝体总RNA,利用试剂盒HiScript II Q RT SuperMix合成cDNA,利用试剂盒ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix进行qPCR,检测各基因的表达量.qPCR反应体系：2×qPCR Master Mix 10 μL、上下游引物各0.4 μL、cDNA 1 μL、ddH2O 8.2 μL;反应程序：95 ℃预变性30 s,95 ℃变性5 s,55 ℃退火15 s,72 ℃延伸 10 s,共40个循环.采用actin作为内参基因,红曲色素合成相关基因的qPCR引物见表2.每个实验样本进行3个生物学重复和3个技术重复.采用2-△△Ct法计算各基因在不同样本中的表达量.

表2 红曲色素合成相关基因的qPCR引物

1.4 数据处理与分析

采用IBM SPSS Statistics 25软件进行数据统计分析,Origin 7.5软件进行绘图.实验数据均重复3次.

2 结果与分析

2.1 红曲色素的紫外-可见吸收光谱特征分析

在红曲色素的发酵产物中,通常同时存在红色素(λmax=490～530 nm)、橙色素(λmax=460～480 nm)和黄色素(λmax=330～450 nm).作为食用色素使用时,红曲色素一般不需要分离纯化,直接以混合物形式使用[23].因此,在红曲色素的常规发酵生产及研究中,紫外-可见吸收光谱法是最常用的色素分析方法,可用于表征红曲色素的色调和色价.红色红曲菌M7在不同发酵温度下所产生红曲色素的紫外-可见吸收光谱分析结果见图1.

a.紫外-可见吸收光谱;b.色价和生物量图1 红色红曲菌M7在不同发酵温度下所产红曲色素的紫外-可见吸收光谱分析Fig.1 UV-Vis spectroscopic analysis of Monascus pigments produced at different fermentation temperatures by M. ruber M7

由图1a可知,在不同温度条件下,红色红曲菌M7所产生的红曲色素在350～550 nm均只有1个吸收峰,其中,在25 ℃和30 ℃时,最大吸收波长为470 nm,色调偏橙,说明在该条件下合成的橙色素较多;在35 ℃和40 ℃时,最大吸收波长分别为415 nm和388 nm,色调偏黄,说明提高发酵温度后,黄色素的比例增大.

由图1b可知,随着温度的升高,510 nm(红色)、470 nm(橙色)和410 nm(黄色)处的色价均先升高后降低,在30 ℃时达到最大值,分别为27、46、26 U/mL;同时,生物量也在30 ℃时达到了最大值.因此,从菌丝生长和色素色价来看,红色红曲菌M7的最适液态发酵温度为30 ℃,与报道的最佳红曲色素发酵温度一致[24-26].

2.2 红曲色素的HPLC指纹图谱特征分析

利用HPLC分析了红色红曲菌M7在不同发酵温度下所产生的红曲色素的组成成分,其HPLC指纹图谱见图2,各色素组分的紫外-可见吸收光谱和质谱分别见图3和图4.

圆饼图为不同色素组分的峰面积百分比图2 红色红曲菌M7在不同发酵温度下所产红曲色素的HPLC图谱Fig.2 HPLC profiles of Monascus pigments produced at different fermentation temperatures by M. ruber M7

图3 不同色素组分的紫外-可见吸收光谱Fig.3 UV-Vis spectra of different pigment components

图4 不同色素组分的质谱Fig.4 Mass spectra of different pigment components

在25～40 ℃,红色红曲菌M7共产生8种色素组分,分别为Y1～Y4、O1～O4(图2),其中,Y1～Y4最大吸收波长为370～390 nm(图3),符合典型的红曲黄色素的吸收光谱特征,准分子离子[M+H]+峰分别为m/z357.17、359.19、385.20和 387.22(图4),结合文献报道[1-2],推断Y1～Y4分别为红曲黄色素中的monasfluore A(MFA, C21H24O5)、MS(C21H26O5)、monasfluore B(MFB, C23H28O5)和AF(C23H30O5);O1～O4的最大吸收波长约为470 nm(图3),符合典型的红曲橙色素的吸收光谱特征,准分子离子[M+H]+峰分别为m/z355.15、387.18、383.18和 415.21(图4),结合文献报道[1-2],推断O1～O4分别为红曲橙色素中的红斑素(RP, C21H22O5)、monasphilol-methoxy A(MMA, C22H26O6)、红曲红素(MR, C23H26O5)和monasphilol-methoxy B(MMB, C24H30O6).

如图2所示,当发酵温度为25 ℃和30 ℃时,共检测到2种黄色素和4种橙色素组分,分别为MS(Y2)、AF(Y4)、RP(O1)、MMA(O2)、MR(O3)和MMB(O4),其中RP(O1)和MR(O3)的峰面积百分比较大,共约为71%(25 ℃)和79%(30 ℃),其次为MS(Y2)和AF(Y4),共约占23%(25 ℃)和14%(30 ℃);当发酵温度升到35 ℃时,检测到全部的8种色素组分,峰面积百分比较大的组分除了RP(O1)和MR(O3),共约占49%,还包括MS(Y2)和AF(Y4),共约占38%;当发酵温度升到40 ℃时,检测到4种黄色素和2种橙色素组分,分别为MFA(Y1)、MS(Y2)、MFB(Y3)、AF(Y4)、RP(O1)和MR(O3),峰面积百分比较大的为MS(Y2)和AF(Y4),共约占55%,其次为MFA(Y1)和MFB(Y3),共约占33%.由此可见,提高发酵温度至35 ℃以上,有利于提高红曲色素产物中黄色素组分MS(Y2)、AF(Y4)、MFA(Y1)、MFB (Y3)的比例.该结果与图1所示的不同发酵温度下红曲色素发酵产物的紫外-可见吸收光谱特征相符合.

2.3 红曲色素组分的产量分析

至今已报道的红曲色素组分有100多种[1],但目前的研究主要集中于6种主要的色素组分,包括2种黄色素组分MS(Y2)和AF(Y4)、2种橙色素组分RP(O1)和MR(O3)、2种红色素组分红斑胺(rubropunctamine,RPA)和红曲红胺(monascorubramine,MRA).利用HPLC对所检测到的8种色素组分分别进行了定量分析,其中MFA(Y1)、MFB(Y3)、MMA(O2)和MMB(O4)4种色素为非主要色素组分,目前研究较少,还未见商业化的标准品,参照Huang等[18]利用HPLC峰面积对其进行了相对定量,每产生1 000 mAu·s峰面积的色素量记为1 AU,结果见图5.

a.橙色素;b黄色素图5 红色红曲菌M7在不同发酵温度下的红曲色素组分产量Fig.5 Yields of different Monascus pigment components produced by M.ruber M7 at different fermentation temperatures

由图5可知,随着温度的升高,各色素组分的产量均先升高后降低.在25 ℃和40 ℃时,各色素组分的产量均显著低于30 ℃和35 ℃(P<0.05);在30 ℃时,4种橙色素的产量均达到最大值,其中2种主要橙色素组分RP(O1)和MR(O3)的产量分别为107 mg/L和124 mg/L,而2种主要黄色素组分MS(Y2)和AF(Y4)的产量较低,分别为48 mg/L和26 mg/L;在35 ℃时,4种黄色素的产量均达到最大值,其中2种主要黄色素组分MS(Y2)和AF(Y4)的产量分别为100 mg/L和47 mg/L,而2种主要橙色素组分RP(O1)和MR(O3)的产量相对30 ℃显著下降(P<0.05),分别为57 mg/L和50 mg/L.由此可见,将培养温度从30 ℃提高到35 ℃,虽然色素总量显著下降(P<0.05),4种主要色素组分RP(O1)、MR(O3)、MS(Y2)和AF(Y4)的总产量由305 mg/L降到了254 mg/L,但能显著促进黄色素的产生,可使MS(Y2)和AF(Y4)的总产量提高98%.

2.4 红曲色素生物合成相关基因表达量的分析

目前,红曲色素生物合成途径已经得到初步阐释[1-2],其中6种主要色素成分的合成过程如下：聚酮合酶MrPigA以乙酰辅酶A、丙二酰辅酶A和S-腺苷甲硫氨酸为底物,合成得到聚酮化合物,再经过还原、氧化步骤,生成红曲色素的嗜氮酮母环结构;脂肪酸合成酶MrPigJ和MrPigK以乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A为底物,合成得到的β-酮酸被酰基转移酶转移到嗜氮酮母环的羟基上,再经过一系列反应生成一对色素中间体1和2;FAD氧化还原酶MrPigF和烯酰还原酶MrPigH催化色素中间体1和2分别发生氧化、还原反应,使红曲色素的合成途径分成2条支路,一条支路流向橙色素组分RP(O1)和MR(O3),另一条支路流向黄色素组分MS(Y2)和AF(Y4);橙色素组分RP(O1)和MR(O3)在中性条件下,与菌体内源NH3发生自发的嗜氮加成反应(azaphilic addition reaction),转化生成红色素组分RPA和MRA(图6).在本研究条件下,未检测到明显的RPA和MRA(图2),且发现发酵液的pH始终维持在3.0以下,可能是生理酸性氮源(NH4)2SO4导致了培养基酸化[27],抑制了嗜氮加成反应.

该合成途径根据参考文献[1]简化而来.单实线箭头表示单酶催化的反应;双实线箭头表示多酶催化的多步反应.向下和向上箭头表示发酵温度从30 ℃ 提高到35 ℃后,发酵中后期(5～7 d)相关基因表达水平的变化,其中绿色向下箭头表示表达水平发生下调,红色向上的箭头表示表达水平未发生下调(上调或不变).图6 不同红曲色素组分的生物合成途径及关键基因表达水平的变化Fig.6 Biosynthetic pathway of different pigment components and the changes in expression levels of the key genes

由上述红曲色素生物合成过程(图6)可知,MrPigA、MrPigJ和MrPigK在红曲色素合成的起始步骤中发挥作用,其基因表达量的变化与红曲色素总量的变化密切相关;MrPigF和MrPigH在橙色素和黄色素的合成分支节点上发挥作用,一方面,其基因表达量的高低分别与橙色素和黄色素产量的高低密切相关,另一方面,二者的相对表达量(即表达量比值MrPigH/MrPigF)的变化会影响色素的分支代谢流向,从而改变橙色素和黄色素的生成比例.因此,分析了温度对红色红曲菌M7中MrPigA、MrPigJ、MrPigK、MrPigF和MrPigH基因表达量的影响,结果见图7.

不同小写字母代表差异显著,P<0.05图7 不同温度下红曲色素合成基因簇中关键合成酶基因的表达量Fig.7 Expression levels of key genes in the biosynthetic gene cluster of Monascus pigments

由图7A-C可知,温度从30 ℃升高到35 ℃,MrPigA、MrPigJ、MrPigK的表达水平在发酵过程的第3、5、7天均发生显著下降,说明高温不利于这些关键合成酶基因的转录,使色素的合成在起始步骤中即受到抑制,该结果与红曲色素总色价(图1)和4种主要色素总产量(图5)下降的结果表现一致.

由图7D可知,温度从30 ℃升高到35 ℃,MrPigF表达水平的变化趋势同MrPigA、MrPigJ和MrPigK相似,在第3、5、7天均发生显著下降,该结果与橙色素组分RP(O1)和MR(O3)产量的减少相一致(图5).相比之下,MrPigH的表达水平仅在早期(第3天)显著下降,而在中期(第5天)显著升高,在后期(第7天)无显著差异(图7E),导致表达量比值MrPigH/MrPigF在中期(第5天)和后期(第7天)显著升高(图7F),表明温度对橙色素和黄色素合成分支节点关键酶基因MrPigH和MrPigF在转录水平的调节作用存在明显差异,该调节差异可能是导致代谢流向黄色素改变,使MS(Y2)和AF(Y4)产量显著提高的主要原因(图6).

3 讨论

从结构上看,目前报道的大部分红曲色素均由1个嗜氮酮母环和1条脂肪族侧链组成,其中,脂肪族侧链是由MrPigJ和MrPigK组成的异源二聚体脂肪酸合成酶负责合成[1-2].由于异源二聚体脂肪酸合成酶MrPigJ-MrPigK在碳链长度的控制上不严格,能同时产生2种不同长度的产物,即β-酮基辛酸和β-酮基癸酸,因此,红曲色素一般成对出现,二者仅在脂肪族侧链上相差2个碳原子.本研究,检测到的8种色素组分,实质上为4对色素产物,分别是MFA(Y1)和MFB(Y3)、MS(Y2)和AF(Y4)、RP(O1)和MR(O3)、MMA(O2)和MMB(O4).

紫外-可见吸收光谱法是目前最常用的红曲色素分析方法,可用于表征红曲色素的色调和色价.该方法简单,方便,不需要标准品,成本低.然而,3类红曲色素的吸收带较宽,存在相互干扰的情况.例如：橙色素组分RP(O1)和MR(O3)(图3)及红色素组分RPA和MRA[2]均在400 nm附近有较大吸收,可干扰黄色素的测定.近年来,越来越多的研究开始关注红曲色素的组成成分,采用的检测方法包括TLC和HPLC等[18-19,27-32].与此同时,中国食品安全国家标准GB 5009.150—2016《食品中红曲色素的测定》规定了MS(Y2)、MR(O3)和MRA 共3种色素组分的HPLC测定;中国出入境检验检疫行业标准SN/T 3843—2014《出口食品中红曲色素的测定》规定了4种红曲色素组分的HPLC测定,除了GB 5009.150—2016中的3种,还包括AF(Y4).然而,红曲色素的种类有100多种[1],目前可获得的商品化红曲色素标准品只有6种主要色素组分,即黄色素组分MS(Y2)和AF(Y4)、橙色素组分RP(O1)和MR(O3)、红色素组分RPA和MRA,而且价格昂贵,因此,一些研究仅利用HPLC峰面积大小或TLC色斑深浅对色素组分进行相对定量[18-19,30,32].由此可见,研究不同色素组分的发酵条件,提高其产量,不仅有利于高附加值红曲色素组分的产业化生产,也有利于解决红曲色素标准品相对匮乏的现状.

MS(Y2)和AF(Y4)因其良好的稳定性和生物活性[5-10],受到广泛关注.在台湾畅销的保健食品“娘家大红曲胶囊”,其功能性成分为MS(Y2)和AF(Y4),用于血脂和血糖的调节.在常规红曲色素发酵条件下,MS(Y2)和AF(Y4)不是优势组分,产量较低,是制约其产业化发展的瓶颈之一.因此,研究影响红曲菌产生MS(Y2)和AF(Y4)的因素,对提高MS(Y2)和AF(Y4)的发酵水平有重要意义.Patrovsky等[27]研究了氮源和培养基初始pH值对紫色红曲菌(M.purpureus)DBM 4360产生黄色素和橙色素的影响,发现适宜氮源为蛋白胨,适宜pH值为2.5,该条件下单位质量菌丝体的MS(Y2)和AF(Y4)总产量为72.8 mg/g.本研究通过提高发酵温度至35 ℃,使红色红曲菌M7单位质量菌丝体的MS(Y2)和AF(Y4)总产量提高到66.4 mg/g,接近Patrovsky等[27]报道的适宜条件下的MS(Y2)和AF(Y4)产量.下一步研究中,有待结合温度,对发酵培养基组成和其他发酵条件进行优化,以期进一步提高MS(Y2)和AF(Y4)的产量.

温度是影响微生物生长和代谢的重要因素.本研究发现,红色红曲菌M7在30℃和35 ℃条件下形成的生物量无显著性差异(图1),说明温度并非主要通过影响生长来影响红曲色素的合成.qPCR分析发现,红曲色素合成关键酶基因表达量的变化与橙色素、黄色素产量的变化有一定的相关性(图5～7),说明温度对红曲色素液态发酵的影响与其对色素合成关键酶基因的转录调控密切相关,其具体机制还有待进一步研究.此外,色素合成关键酶基因转录后的翻译和酶活也可能会受到温度的影响,需要进一步探讨.

目前,红曲色素生物合成途径已经得到初步阐释[1-2],其中6种主要色素成分的合成过程较清楚(图6),而黄色素组分MFA(Y1)和MFB(Y3)、橙色素组分MMA(O2)和MMB(O4)等多种其他色素组分的具体合成过程及关键酶还有待阐述.本研究发现,温度对MFA(Y1)、MFB(Y3)、MMA(O2)和MMB(O4)也有显著影响.在此基础上,通过转录组、蛋白组等组学技术进行分析,可为红曲色素生物合成途径的进一步完善提供线索.