苦参碱逆转外排泵系统AcrAB-ToIC介导的耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌对替加环素的耐药性*

伍慧妍,钟瑶,詹铀超,彭亮,张艳玲

(1.广州医科大学附属第五医院检验科,广州 510799;2.广州医科大学金域学院医学检验系,广州 510180;3.嘉应学院医学院医学检验系,梅州 514031)

肺炎克雷伯菌是医院内获得性感染重要条件致病体[1],碳青霉烯类药物是治疗肺炎克雷伯菌的重要抗菌药物[2]。由于近年来临床上碳青霉烯类药物使用的增加以及药物的选择性压力下,耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(Carbapenem-resistantKlebsiellaPneumoniae,CRKP)在全球范围内不断出现,在国内的检出率占比也不断升高[3-4]。目前,替加环素(tigecycline,TGC)是治疗CRKP的首选用药方案之一[5-7]。据中国细菌耐药监测研究2019—2020革兰阴性菌监测报告显示,CRKP对替加环素耐药率为8.9%,并呈逐年递增趋势[3],给临床治疗CRKP导致的感染提出了一大挑战。新型替加环素联合用药模式可为减小抗生素“选择性压力”提供新思路。AcrAB-TolC系统是CRKP最重要的、最经典的多药外排系统[8]。CRKP对替加环素的耐药性主要是由上述外排泵及其相应的调节基因MarA、RamA和AcrB、AcrR方面发挥着作用[9]。中药单体苦参碱(matrine,MAT)具有广谱抗菌作用,且MAT能下调大肠埃希菌中AcrAB-TolC的表达[10]。因此本研究选择中药单体苦参碱作为研究对象,评估其对外排泵系统AcrAB-TolC介导的CRKP对替加环素耐药性的影响,探究其逆转耐药性的相关调控机制,为后续研究中药抗多重耐药机制,提高CRKP感染的疗效,降低患者死亡率提供理论依据。

1 材料与方法

1.1研究菌株 本实验菌株来源于广州医科大学附属第五医院检验科菌种资源库。实验组(CRKP-TR):经检验科微生物室Microflex LT/SH全自动生物质谱检测系统鉴定为肺炎克雷伯菌;并通过VITEK-2 COMPACT全自动药敏系统检测出为碳青霉烯类耐药且替加环素耐药或中介;并经分子生物学实验室罗氏cobas Z480荧光定量聚合酶链式反应(PCR)仪检测(与对照组相比)高表达AcrB、MarA、RamA,低表达AcrR基因;一共31株。对照组(CRKP-TS):选用由广州医科大学附属第五医院检验科微生物室通过对肺炎克雷伯质控株(ATCC4352)体外多步诱导法诱导的对碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌,并对替加环素药敏敏感的菌株。菌株统一保存于-20℃冰箱。本研究通过伦理委员会批准,批件号:KY02-2022-03-04。

1.2实验耗材 苦参碱(江苏永健对照品公司,含量>99%,批号:102750);替加环素(上海士锋生物制品有限公司,含量>98%,批号:220620-09-7); 水解酪蛋白培养基(广东环凯微生物科技有限公司,批号:1103531);哥伦比亚血琼脂培养基(江门市凯林贸易有限公司,货号:P0901);细菌总RNA提取试剂盒(浙江联硕生物科技有限公司,批号:19301ES50);逆转录试剂盒(批号:W9813)、qRT-PCR 试剂盒(批号:W9730)来源于北京天根生化科技有限公司;引物合成均来自广州艾基生物技术有限公司;Microflex LT/SH全自动生物质谱检测系统(美国布鲁克·道尔顿公司);VITEK 2 COMPACT细菌药敏分析仪(法国BIOMERIEUX公司);ELX800酶标仪(美国Bio-Tek宝特公司);Cobas Z480实时PCR扩增仪(瑞士罗氏公司)。

1.3药物配制 称取苦参碱粉末1 g,溶于20 mL纯化水中配制成浓度50 000 mg·L-1的母液,充分混匀,分装至EP管中保存,标好药名及配制日期,保存于2～8 ℃冰箱,实验时用纯化水稀释成相应浓度。 称取替加环素250 mg溶于0.9%氯化钠溶液12.5 mL中,配制成浓度为20 000 mg·L-1母液,充分混匀,分装至EP管中并标记好名称和配制日期,放于-20 ℃冰箱保存,根据实验需要用0.9%氯化钠溶液稀释成相应浓度。

1.4菌液制备 取冷藏保存的替加环素敏感的CRKP和替加环素耐药或中介的CRKP接种于哥伦比亚血琼脂培养基上,放置于普通培养箱中,在37 ℃下培养24 h后,获得目标菌落的单个纯菌落,在生物安全柜中用无菌接种环挑取单菌落于无菌0.9%氯化钠溶液配成菌悬液,利用麦氏比浊法调节菌悬液浓度为0.5个麦氏浊度(相当于 1.5×108CFU·mL-1)。

1.5联合抑菌试验 使用棋盘稀释法,每个96孔板中每孔加入水解酪蛋白培养基150 μL。从A排到G排第2列加入150 μL苦参碱倍比稀释至第11列。从第2列到11列第A排起加入替加环素5 μL倍比稀释至第G排。最终苦参碱终浓度为9.77,19.53,39.06,78.125,156.25,312.5,625,1 250,2 500,5 000 mg·L-1,10个梯度浓度,替加环素终浓度为2,4,8,16,32,64,128 mg·L-1,7个梯度浓度。在第H排设置以上浓度的苦参碱单药对照组,第12列设置以上浓度的替加环素单药对照组。第1列A-D孔只加水解酪蛋白培养基为阴性对照。第1列E-H孔只加入试验菌液为阳性对照。取菌液5 μL(CRKP-TS或CRKP-TR)接种于96孔中。培养24 h后,使用ELX800酶标仪测定波长450 nm、参比波长620 nm测定各孔吸光度值,测定药物最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC),并计算部分抑菌浓度(fractional inhibitory concentration,FIC)指数和抑菌率[11]。

1.6外排泵基因的表达测定 细菌总RNA提取试剂盒提取细菌RNA,包括CRKP-TS、CRKP-TR及其棋盘稀释法相对应得到的耐药逆转孔对应的单药、联合药孔。RNA的逆转录后得到的逆转录产物cDNA放置于-20 ℃下的冰箱保存。 qRT-PCR所需引物序列结合文献[12]报道并根据相关引物设计原则,在美国国家生物技术信息中心(NCBI)网站Gene数据库中找到相关基因序列并使用在线引物设计功能设计引物,见表1。使用三步法PCR反应扩增程序:一为预变性:95 ℃,3 min,循环数为1。二为PCR反应:95 ℃,5 s(变性);60 ℃,10 s(退火);75 ℃,15 s(延伸),循环数为40,罗氏cobas Z480实时PCR扩增仪中进行检测。以16sRNA作为内参基因进行校准,AcrB、MarA、RamA、AcrR基因相对表达丰度用ΔΔCT法分析。

表1 AcrAB-ToIC外排泵基因的引物序列

2 结果

2.1两组CRKP替加环素与苦参碱的MIC值 对照组(CRKP-TS)的替加环素MIC为2 mg·L-1,苦参碱的MIC为(3 500±1 369.31) mg·L-1;实验组(CRKP-TR)的替加环素MIC为(38.18±21.76) mg·L-1,苦参碱的MIC为(3 181.82±1 139.61) mg·L-1。可见实验组(CRKP-TR)与对照组(CRKP-TS)相比较,该31株替加环素耐药的CRKP,替加环素的MIC值均明显升高,但苦参碱的MIC值无明显变化(表2)。对实验组与对照组共32株CRKP进行苦参碱MIC的检测,最后发现苦参碱对CRKP的MIC值为3 125 mg·L-1。

表2 两组CRKP替加环素与苦参碱的MIC值

2.2替加环素与苦参碱联合应用前后CRKP-TR组药物MIC值变化情况 与单用替加环素或苦参碱相比较,替加环素与苦参碱联合用药后,无论是替加环素还是苦参碱,其MIC值均明显降低,而且31株CRKP-TR组的替加环素MIC值均能恢复至替加环素敏感MIC值与表2对照组中替加环素MIC值无区别,见表3。

表3 替加环素与苦参碱联合应用前后MIC值的变化情况

2.3替加环素与苦参碱联合应用前后对CRKP-TR组抑菌率的变化情况以及FIC指数的影响 单用替加环素作用CRKP-TR组,抑菌率为0.638±0.085;单用苦参碱抑菌率为0.628±0.032。在单药作用下,对CRKP-TR组的抑菌效果相同(P=0.812)。当两种药物联合用药时,抑菌率可达0.856±0.136;与单用替加环素组或苦参碱组相比较,相同浓度的替加环素与苦参碱联合应用后对CRKP-TR组抑菌率明显提高(P<0.05),见图1。

①与两单药组比较(与替加环素比较:t=5.44;与苦参碱比较:t=4.83),均P<0.05。

CRKP-TR组中经过VITEK-2 COMPACT全自动药敏系统检测出为替加环素耐药25株(81%)、中介6株(19%),31株CRKP-TR经过替加环素与苦参碱联合应用主要表现为协同作用有14株占45%,相加作用有17株占55%;替加环素中介在经过苦参碱联合作用后抑菌效果更为明显,6株均呈现协同作用。另外,无关作用和拮抗作用均无出现(表4)。说明苦参碱能提高替加环素对替加环素耐药的CRKP的药物疗效。

表4 替加环素与苦参碱联合应用后FIC指数

2.4逆转耐药前后AcrAB-TolC外排泵膜蛋白基因的表达情况 qRT-PCR检测结果显示,与CRKP-TS组比较,CRKP-TR组31株AcrAB-TolC外排泵的正向调控MarA、RamA、AcrB的基因相对表达量均明显升高(P<0.05),而负向调控AcrR基因相对表达量明显降低(P<0.05),见图2。

①与对照组(CRKP-TS)比较,MarA:t=4.16;AcrB:t=5.22;AcrR:t=5.59;RamA:t=5.70,P<0.05。

替加环素与苦参碱联合应用前后CRKP-TR中的AcrAB-TolC外排泵MarA、RamA、AcrB及AcrR基因的表达变化情况的评估结果如图3所示。单用替加环素与无药物处理CRKP-TR相比较,MarA、RamA、AcrB及AcrR基因的表达差异无统计学意义(P>0.05)。单用苦参碱与用药前相比较,除MarA基因的表达差异无统计学意义(P>0.05),RamA、AcrB表达分别约下调8倍、 3倍,而AcrR表达增加6倍(P<0.05),证明苦参碱能引起RamA、AcrB及AcrR基因表达改变。联合用药后CRKP-TR组与无药物处理CRKP-TR组相比较,MarA、RamA、AcrB基因的表达均明显降低(P<0.05)AcrR基因表达升高7.86倍(P<0.05)。说明苦参碱与替加环素联合应用后对外排泵AcrAB-TolC表达的抑制作用更为显著。

①与用药前比较,MarA:t=5.61;AcrB:t=4.78-6.40;AcrR:t=2.43-3.17;RamA:t=7.81-7.98,P<0.05。

因替加环素中介在经过苦参碱联合作用后抑菌效果比替加环素耐药时更为明显,均呈现协同作用。本研究分别检测苦参碱作用后和苦参碱联合替加环素作用后,CRKP-TR组中替加环素中介的外排泵表达的变化,但发现外排泵膜蛋白基因表达层面没有差异性改变(P>0.05),见图4。

图4 CRKP-TR组中替加环素耐药(R)与中介(I)在联合药物作用后外排泵膜蛋白基因表达情况

3 讨论

医院感染中CRKP的检出率不断升高,致病菌耐药性已是不争的事实,也是全球面临的挑战。替加环素虽有独特的抗菌特性,是作为临床常见的多重耐药阴性杆菌菌感染基础经验治疗用药[13],在临床上使用方便,不需要根据肾功能的受损情况来调整剂量[5,9],但同样也已出现替加环素耐药株。单一使用过度,势必会加快新药耐药的步伐。这就给治疗多重耐药菌导致的感染提出了一大难题。因此,为减少对于临床对传统抗菌药物的过度依赖,寻找可能有效的抗菌新方案,是目前解决CRKP导致的感染治疗的一大需求。近年有研究表明,板蓝根和土霉素的联合作用对枯草芽孢杆菌存在协同的抗菌效果[14];杨梅素和美罗培南联合应用可以逆转对美罗培南的耐药[15]。可见中西药联合治疗也是一种对抗多重耐药菌的新型手段。因此,本文选择苦参碱为中药研究药物,且苦参碱已经在临床中投入使用,毒副作用低[10]。

本研究结果显示,替加环素和苦参碱联合使用,二者的药理作用表现为协同或相加作用;其中CRKP替加环素中介的FIC都小于0.5,表明替加环素与苦参碱联合作用对中介的抑菌效果更为明显。鉴于临床对替加环素中介用药需要增加药物频次使用,这会极大增加其选择性压力。因此,与苦参碱联合使用,或许能延长替加环素的使用寿命。联合用药与单药组相比,对CRKP替加环素耐药的抑菌率明显升高,说明苦参碱和替加环素联合使用后抗菌效果理想。联合用药后,替加环素与苦参碱的MIC值均明显降低,其中,替加环素的MIC值均能恢复至CRKP替加环素敏感MIC值。以上结果说明苦参碱能逆转CRKP对替加环素耐药性。与之前研究结果[10],即苦参碱能够使多重耐药的大肠埃希菌对抗菌药物恢复敏感的结果具有一致性。

细菌的耐药机制较为复杂和多样,CRKP的耐药机制主要涉及碳青霉烯酶的产生、产AmpC酶或ESBLs合并外膜孔蛋白缺失或改变、外排泵的过度表达、生物被膜的形成等多种机制介导[8]。外排泵的过度表达在CRKP对替加环素耐药性方面发挥着主导地位[9]。现在也普遍认识到在基因水平上调控外排泵表达是治疗多重耐药的一个手段,AcrAB-TolC是革兰阴性菌中RND家族最具临床意义的外排泵系统,当此外排系统发生过表达时,导致菌体内浓度下降,不足以在体内达到有效的杀菌效果,就有利于细菌在存在抗菌药物的环境中生存。因此本研究通过外排泵AcrAB-TolC调控作为突破点探索治疗CRKP的新策略。本研究结果显示,苦参碱和替加环素联合应用能够调控CRKP外排泵AcrAbB-TolC的基因表达,下调MarA、RamA和AcrB的基因表达,抑制AcrAB的转录,上调AcrR的表达,逆转由外排泵系统AcrAB-TolC介导的CRKP对替加环素的耐药,使CRKP重新对替加环素敏感。这与研究[10]发现苦参碱能够调控大肠杆菌中AcrAB-TolC中的调控因子MacA、AcrR、RamA以达到抑制外排作用相同。并且用单药苦参碱组处理后,除了MarA基因表达无明显差异外,抑制了RamA、AcrB基因的表达,或许CRKP对替加环素耐药的机制跟RamA或AcrB更有相关性,以往也有研究提出了肺炎克雷伯菌的AcrAB-TolC主要是RamA控制的观点[16]。且本研究针对耐药逆转前后AcrAB-TolC外排泵膜蛋白基因的表达情况,仅使用RT-PCR检测手段进行探讨,需要后续进一步补充其他实验检查已达相互佐证,因此,检测结果存在的一定缺陷,暂只是初步论证。另外,本课题推断苦参碱可作为外排泵AcrAB-TolC的调控因子。但目前关于苦参碱如何下调AcrAB-TolC外排泵的作用原因还未能查证,所以对探索苦参碱和CRKP的AcrAB-TolC外排泵调控机制之间关联性需做出进一步的研究。

综上所述,苦参碱与替加环素联合应用后替加环素的MIC下降,两者可起到协同或相加的作用,使得抗菌药物的效果得以改善,为临床耐药菌治疗提供中药与抗菌药物联合用药的新思路。外排泵基因的表达与致病菌的生物膜的生长呈正相关,而中药单体联合抗菌药物对生物膜形成有抑制作用[17]。本研究结果显示,苦参碱与替加环素联合应用后,CRKP替加环素中介与替加环素耐药的菌株相比,抑菌效果更明显,均为药理协同作用;但通过比较基因表达情况,并未发现外排泵膜蛋白基因表达层面有差异。猜测联合用药后对CRKP替加环素中介的抑菌效果更好,跟逆转外排泵系统的表达无关,或许跟生物膜具有一定关系,具体原因仍需进一步实验验证。所以关于苦参碱是否能够在下调外排泵系统AcrAB-TolC表达后进一步影响生物膜的形成,从而有助于苦参碱逆转AcrAB-TolC介导的耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌对替加环素的耐药性是我们下一步需要进行研究的方向。