铁皮石斛一步成苗影响因子试验研究

李得萍 陈一鸣 何远秦 董洪雨 易元惠 刘艳军

摘要：为优化铁皮石斛一步成苗培养条件，文章通过正交试验研究培养容器、培养基用量、接种材料株高以及接种密度4个因素对铁皮石斛组培苗生长的影响，筛选出最适宜铁皮石斛组培苗一步成苗的培养组合；研究铁皮石斛组培苗一步成苗过程中添加激素和活性炭对植株生长的影响，筛选确定铁皮石斛组培苗一步成苗的最优培养组合。试验结果表明，培养容器是影响铁皮石斛组培苗一步成苗生长的主要影响因素，培养基用量、接种材料株高以及接种密度3个因素分别对铁皮石斛组培苗的不同生长指标产生影响；基本培养基中添加激素对铁皮石斛组培苗一步成苗的效果较好，优于对照（CK）基本培养基；一步成苗培养基中添加活性炭的效果低于对照（CK）一步成苗培养基。试验确定铁皮石斛组培苗一步成苗的最优培养组合为：培养容器240 mL、培养基用量40 mL、接种材料株高

1.2 cm、接种密度4芽·瓶-1，培养120 d后铁皮石斛组培苗的分蘖量为6.55个，符合出苗标准的合格率为93.67%。

关键词：铁皮石斛；正交试验；接种密度；活性炭：一步成苗

中图分类号：R284

文献标识码：A

铁皮石斛为兰科石斛属多年生附生草本植物，是十大仙草之首，因其具有极高的药用价值而被开发利用[1]。石斛属种子细小入微，没有胚乳，在自然条件下很难自然萌发增殖，主要繁殖方式为分株、扦插等[2]，繁殖速度较慢，培养周期长，产量不高。因此，为加快铁皮石斛的繁殖速度以及保护濒危物种，通常采用组织培养来解决这一难题[3-4]。近年来，关于铁皮石斛的组培快繁研究较多，也建立了相应的快繁体系[5-6]。由于人工成本越来越高，相应的组培苗成本也逐渐提高，从而导致石斛生产成本上涨，种植效益降低，降低组培苗的生产成本成为发展石斛组培快繁的有效途径。本试验采用铁皮石斛的组培苗为试验材料，通过对影响铁皮石斛一步成苗的培养组合进行筛选优化，建立铁皮石斛一步成苗组培快繁体系，为工厂化生产优质、低成本和遗传稳定的石斛兰种苗、为石斛快繁技术的发展提供依据。

1  材料和方法

1.1   试验材料及试验设计

铁皮石斛组培苗：由天津农学院东校区组培室提供。

供试试剂：活性炭（AC）、生长素NAA（1-萘乙酸）、MS培养基、水解乳蛋白（LH）等试剂均由天津农学院实验室提供。

采用L9（34）正交试验设计研究培养容器类型、培养基用量、接种材料株高以及接种密度对铁皮石斛组培苗一步成苗的影响，筛选出适宜铁皮石斛一步成苗的培养组合。试验设计见表1，正交试验设计组合见表2。

上述培养基均为1/2MS+0.1 g·L-1 LH（水解乳蛋白）+0.2 mg·L-1 NAA+25 g·L-1蔗糖。将生长一致的铁皮石斛组培苗接种到培养基中，每个处理接种15瓶，重复3次。培养120 d 后，调查铁皮石斛株高、茎粗、生根数、叶片数等生长情况。

1.2 基本培养基添加激素对铁皮石斛组培苗一步

成苗的影响

试验设2个培养基处理，即基本培养基添加激素（1/2MS+0.1 g·L-1LH +0.2 mg·L-1 NAA+25 g·L-1蔗糖）和基本培养基（1/2MS+0.1 g·L-1 LH+25 g·L-1蔗糖）。将生长一致、株高0.8 cm的铁皮石斛组培苗分别接种到上述2个培养基中，120 d后调查铁皮石斛株高、茎粗、叶片数、生根量、分蘖量等生长情况。

1.3 基本培养基添加活性炭对铁皮石斛组培苗

一步成苗的影响

1.3.1 基本培养基添加不同数量活性炭对铁皮石斛组培苗生长的影响 试验设6个培养基处理，即以1/2MS基本培养基为对照（CK），其他5个处理为在1/2MS基本培养基中分别添加0.1、0.25、0.5、0.75、1 g·L-1的活性炭。将生长一致、株高0.8 cm的铁皮石斛组培苗分别接种到上述6个培养基中，45 d后调查铁皮石斛株高、茎粗、生根量、分蘖量等生长情况。

1.3.2 一步成苗培养基添加活性炭对铁皮石斛组培苗生长的影响 试验设2个培养基处理，即以一步成苗培养基（1/2MS+0.1 g·L-1 LH+0.1 mg·L-1 NAA）为对照（CK），另一处理为根据1.3.1的试验结果，将效果较好的活性炭（浓度为0.25 g·L-1）添加到一步成苗培養基中。将生长一致、株高0.8 cm的铁皮石斛组培苗接种到上述2个培养基中，培养120 d后调查铁皮石斛茎粗、株高、生根量、分蘖量等生长情况。

1.4   铁皮石斛组培苗一步成苗优化试验

根据正交试验，将结果较好的处理组合2（A1B2C2D3）、处理组合3（A1B3C3D2）和处理组合6（A2B3C1D3）以及最优处理组合（A1B2C1D2）进行重复试验，培养120 d后调查符合铁皮石斛出苗标准的合格率、植株分蘖量等生长情况。

根据浙江省发布的铁皮石斛组培苗出苗标准，用于栽培的铁皮石斛苗应为非污染、无烂茎、无烂根、无黄叶；叶片4片以上，正常展开，叶色呈嫩绿或翠绿，根条数2～3条，株高≥2.5 cm，茎粗≥0.2 cm；合格苗应在总量的80%以上。

1.5   培养条件

试验于2022年3—7月在天津农学院组培室进行，试验基本培养基为1/2MS，蔗糖含量25 g·L-1、琼脂含量6.6 g·L-1，pH 5.8～6.0，培养温度28 ℃～30 ℃，光照强度2 000～2 500 lx，连续照明培养。

1.6   数据处理与分析

用Excel 软件进行数据分析，用SPSS 20.0进行差异显著性比较、极差处理和方差分析。

分蘖量 = 总植株数

接种植株数

出苗合格率（%） = 符合出苗标准的数量 ×100

总植株数

2  结果与分析

2.1   正交试验对铁皮石斛组培苗的影响

2.1.1 正交试验对铁皮石斛一步成苗的影响 由表3和图1可见，处理组合3（A1B3C3D2），即培养容器为240 mL培养瓶、培养基用量60 mL、接种材料株高1.2 cm、接种密度4个芽·瓶-1对铁皮石斛组培苗的培养效果较好，植株平均茎粗2.95 mm、株高2.98 cm、生根量3.98条、叶片数5片，植株长势良好，葉片大且颜色深绿，分蘖多。

处理组合6（A2B3C1D3），即培养容器为350 mL培养瓶、培养基用量60 mL、接种材料株高0.5 cm、接种密度6个芽·瓶-1，植株平均茎粗2.83 mm、株高2.91 cm、生根量4.13条、叶片数4.68片，植株长势好，叶大茎粗，分蘖多。处理组合7（A3B1C3D3）培养效果较差，即培养容器为650 mL培养瓶、培养基用量20 mL、接种材料株高1.2 cm、接种密度6个芽·瓶-1的铁皮石斛各项生长指标较差，植株长势老弱，分蘖少。

2.1.2 正交试验对铁皮石斛组培苗植株形状的影响 因素A即培养容器类型对铁皮石斛组培苗茎粗、生根量、叶片数影响较大，R值均为最高；因素B即培养基用量对铁皮石斛组培苗生根量和叶片数的影响较小，R值均最小；因素C即接种材料大小对铁皮石斛组培苗株高的影响较大，R值最高；D因素即接种密度对铁皮石斛组培苗茎粗和株高的影响较小，R值最小（表4）。由此可见，影响铁皮石斛组培苗茎粗和株高的因素排序为C>A>B>D，影响铁皮石斛组培苗生根量和叶片数的因素排序为A>C>D>B。整体而言，A因素即培养基容器类型对铁皮石斛组培苗茎粗、株高、生根量、叶片数的影响最大。

通过比较各因素的均值得知（表4），铁皮石斛组培苗茎粗在A因素下以k1值最大，即A因素的优水平为培养容器240 mL；同理，B因素的优水平为培养基用量40 mL，C因素的优水平为接种材料株高0.5 cm，D因素的优水平为4个芽·瓶-1，即铁皮石斛正交试验的最优培养组合为A1B2C1D2。同理，可以推断出铁皮石斛组培苗株高的最优培养组合为A1B3C2D2，生根量的最优培养组合为A1B2C1D2，叶片数的最优培养组合为A1B2C3D3。综合考虑铁皮石斛的植株性状，应以处理组合A1B2C1D2效果最好，但由于正交试验设计是一种均一性设计，不可能覆盖所有的处理组合，因此最优组合A1B2C1D2在试验中没有显现出来。

2.1.3 正交试验的方差分析结果 由表5可知，A（容器类型）、B（培养基用量）、D（接种密度）对铁皮石斛组培苗茎粗、株高、生根量、叶片数的影响较大，均达到极显著水平；C（接种材料株高）对铁皮石斛组培苗茎粗、生根量、叶片数的作用也达到极显著水平，但对铁皮石斛组培苗的株高影响较小，差异不显著。通过各项指标的F值比较得出，在株高、茎粗、叶片数、生根量这4个铁皮石斛植株形状指标中，A因素作用最大，其次为C因素，主要影响铁皮石斛的茎粗和叶片数，D因素主要影响铁皮石斛的株高和生根量，B因素对铁皮石斛植株各项生长指标影响较小。

综上所述，铁皮石斛一步成苗最优的培养组合为A1B2C1D2，即培养容器240 mL+培养基用量40 mL+接种材料株高0.5 cm+接种密度4个芽·瓶-1为铁皮石斛一步成苗的最优培养组合。

2.2   基本培养基添加激素对铁皮石斛组培苗一步

成苗的影响

基本培养基是否添加激素NAA对铁皮石斛的株高、叶片数、生根量无显著影响，但对铁皮石斛的茎粗影响极显著，对铁皮石斛的分蘖量影响达显著水平（图2和图3、表6）。图2中对照

（CK）为一步成苗基本培养基，V为一步成苗基本培养基添加激素NAA。基本培养基添加NAA处理的铁皮石斛植株各项生长指标均高于对照（CK），培养120 d后植株株高达到2.38 cm、茎粗2.5 mm、生根量4.34条、分蘖量5.12个，植株长势好，叶片宽大，根较长。

2.3   基本培养基添加活性炭对铁皮石斛组培苗一

步成苗的影响

2.3.1 添加不同数量活性炭对铁皮石斛组培苗的影响 由图4可见，当基本培养基添加活性炭浓度为0.25 g·L-1时，铁皮石斛的平均株高和茎粗与添加0.5 g·L-1活性炭时差异不显著，但均显著高于其他活性炭浓度处理和对照（CK）处理。铁皮石斛组培苗的生根量在基本培养基添加0.25 g·L-1活性炭时，显著高于其他处理的生根量，但植株的分蘖量在此浓度下与对照（CK）差异不显著，其他活性炭浓度处理的铁皮石斛组培苗的分蘖量均与对照（CK）差异不显著。铁皮石斛组培苗的生根量在添加0.25 g·L-1活性炭时，显著高于对照（CK）及其他浓度活性炭处理，且当添加的活性炭浓度超过0.5 mg·L-1时，铁皮石斛组培苗基本没有生根量，因此可以得出，添加过高的活性炭浓度可能对铁皮石斛组培苗的生根起到抑制作用。综上所述，基本培养基中添加0.25 g·L-1活性炭对铁皮石斛组培苗的生长具有促进作用，培养45 d后铁皮石斛组培苗平均株高1.29 cm、茎粗2.62 mm、分蘖量2.5个、生根量2.75条，植株长势好，叶片大且颜色深绿。

2.3.2 一步成苗培养基添加活性炭对铁皮石斛组培苗的影响 一步成苗培养基对照（CK）和一步成苗培养基添加0.25 g·L-1活性炭（V）对铁皮石斛组培苗的株高、茎粗没有显著影响，但植株的生根量和分蘖量对照（CK）处理明显优于添加活性炭的处理（图5和表7）。在一步成苗培养基中添加活性炭，培养120 d后铁皮石斛组培苗平均株高2.4 cm、茎粗2.48 mm、生根量1.96条、分蘖量3.21个，长势很弱，基部叶片腐烂，叶片淡绿，叶尖变白。表明一步成苗培养基添加活性炭不利于铁皮石斛组培苗生长，抑制植株生根和分蘖。

从植株长势看，一步成苗培养基中添加活性炭后铁皮石斛组培苗的长势极弱（图6），表明一步成苗培养基添加活性炭对铁皮石斛组培苗生根和分蘖产生了抑制作用。

2.4   铁皮石斛组培苗一步成苗优化试验

由表8可见，处理组合3（A1B3C3D2）与处理组合A1B2C1D2的铁皮石斛组培苗分蘖量以及符合出苗标准的合格率均无显著差异，分蘖量显著高于处理组合6（A2B3C1D3），出苗合格率显著高于处理组合2（A1B2C2D3）。4个处理组合中，处理组合2（A1B2C2D3）显著低于其他处理，植株长势虽然较好，但基部有大量的丛生芽，符合出苗标准的合格率仅为56.16%；处理组合6（A2B3C1D3）植株长势较好，叶片较大，茎粗较粗，但植株的分蘖量显著小于处理组合3（A1B2C3D2）和最优处理组合A1B2C1D2。

试验表明，处理组合3（A1B2C3D2）和最优处理组合A1B2C1D2均适合铁皮石斛一步成苗的培养条件，但处理组合3（A1B3C3D2）效果更突出，即培养容器为240 mL培养瓶、培养基用量60 mL、接种材料株高1.2 cm、接种密度4个芽·瓶-1，更适合铁皮石斛一步成苗生长，培养120 d后植株分蘖量为6.55个，达到出苗标准的合格率为93.67%（表8）。

3  结论与讨论

关于铁皮石斛组培苗培养一步成苗的研究颇多，但大多数研究都与培养基的研究以及外植体的选择有关[7-8]。本试验选用铁皮石斛种子萌发出的微型芽（组培苗）为试验材料，通过培养容器、培养基用量、接种材料株高以及接种密度4个因素3个水平的正交试验，筛选出最佳铁皮石斛组培苗的培养组合，结果显示培养容器是影响铁皮石斛组培苗生长的主要因素，这一结论符合植物生长规律。培养容器空间大，植物呼吸释放的CO2较多；培养容器较小，吸入外界O2少，气体交换量少，而植株吸收CO2过多将导致植株生长不良，因此选用的培养容器为240 mL培养瓶效果较好。培养基用量影响铁皮石斛组培苗的生长，培养基用量不足会导致铁皮石斛组培苗营养不良，培养基用量过多将导致培养湿度过大，不利于铁皮石斛的生长，也造成资源浪费。培养基用量与培养容器大小有关，本试验显示培养容器240 mL适合培养基用量40 mL，培养容器

350 mL适合培养基用量60 mL。试验显示，接种材料大小对铁皮石斛组培苗的生长没有显著影响，这可能由于铁皮石斛自身生长能力较强，一步成苗培养时间较长，后期植株停滞生长。接种密度影响铁皮石斛组培苗的分蘖能力以及生长性能，密度过高，植株吸收的营养和O2較少，长势较弱。因铁皮石斛植株为丛生形态，密度过低不利于植株生长。试验表明，培养容器240 mL适宜的接种密度为4个芽·瓶-1，培养容器350 mL

适宜的接种密度为6个芽·瓶-1。

试验表明，铁皮石斛一步成苗过程中添加激素的生长效果优于对照（CK）；基本培养基中添加0.25 g·L-1活性炭对铁皮石斛组培苗的生长有明显的促进作用，但将同样浓度的活性炭添加到一步成苗培养基（1/2MS+0.1 g·L-1 LH+0.2 mg·L-1NAA+25 g·L-1蔗糖）中培养120 d后，铁皮石斛组培苗长势较弱，叶片变白，极少生根，表明一步成苗培养基添加活性炭对铁皮石斛组培苗产生抑制，这一结论与许多学者研究不一致[9-10]，这可能是由于所选铁皮石斛组培苗外植体的状态不同。本试验所选的铁皮石斛微型芽体内所含的内生菌较少，添加活性炭后吸收过多的培养基营养成分，导致植株吸收营养不足而长势较弱。

本试验得出，铁皮石斛组培苗一步成苗的优化培养条件为培养容器240 mL、培养基用量40 mL、接种材料株高1.2 cm、接种密度4个芽·瓶-1，需添加激素，不添加活性炭。培养120 d后，铁皮石斛组培苗分蘖量为6.55个，符合出苗标准的合格率为93.67%。

参考文献

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