山东规模化兔场致病性大肠杆菌耐药性分析

李 涛，李庆梅，王小伟，卫丽敏，屈平平

（山东畜牧兽医职业学院，山东潍坊 261061）

兔大肠杆菌病，是导致规模化肉兔场幼兔存活率低下和生长发育受阻的重要疾病之一，是由致病性大肠杆菌及其毒素引起的，以水样或胶冻样腹泻为主要特征，死亡率较高，给养兔业造成了严重的经济损失[1-3]。目前，兔大肠杆菌病的防控主要以抗生素的使用为主，但是由于长期使用和滥用抗生素，使得耐药大肠杆菌菌株的产生和传播愈来愈严重，肉兔大肠杆菌病的防控愈来愈困难[4-5]。

本试验通过对山东地区肉兔养殖比较密集的地区（青岛、潍坊、临沂、莱芜）兔场患腹泻病死兔进行细菌分离、纯化、鉴定，并对分离菌株同源性及耐药性进行了分析，旨在为规模化肉兔场腹泻病综合防控提供一定的建议。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品

用于分离大肠肠杆菌的病料来源于患腹泻病死亡的病兔心脏、肝脏、肠系膜淋巴结等病变组织。

1.1.2 主要仪器与试剂

营养琼脂、营养肉汤、伊红美兰培养基、麦基康凯培养基均购自北京陆桥技术股份有限公司；革兰氏细菌染色试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司，细菌药敏试纸盒购自杭州滨河微生物试剂有限公司。

超净工作台、生化培养箱、水浴锅、恒温摇床均购自上海博讯科技有限公司。

1.1.3 引物设计与合成

采用PCR 的方法获得细菌16S rRNA，通用引物序列为：F：5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'；R：5'-TACGCYTACCTTGTTACGACTT-3'，扩增片段大小约为1459p，该引物由上海生工有限公司合成。

1.2 试验方法

1.2.1 大肠杆菌分离与纯化

将因患腹泻病死亡的病兔（死亡时间小于12h）剖检，在无菌条件下取心脏、肝脏、脾脏、肠系膜淋巴结，涂抹于普通营养琼脂平板，37℃生化培养箱过夜培养。次日挑取单个可疑菌落，接种于伊红美兰培养基，37℃生化培养箱过夜培养。次日将疑似大肠杆菌的菌落，再接种于麦康凯培养基，37℃生化培养箱过夜培养，再次鉴定。二次鉴别培养后，将可疑菌株重新接种于营养琼脂平板，重复3～4 次，获得细菌纯培养物，挑取可疑单个菌落进行革兰染色，镜检。

1.2.2 16S rRNA 基因测序及同源性分析

将纯化好的疑似大肠杆菌的菌株送至上海生工生物技术有限公司进行16S rRNA 基因测序，并在NCBI 数据库，运用Blast 软件进行比对。然后利用ggtree 软件进行同源性分析，构建系统发育树。

1.2.3 大肠杆菌耐药性分析

选取10 种常用临床抗菌药物，采用Kirby-Bauer 纸片扩散法进行。用灭菌棉拭子蘸取菌液均匀涂布在普通培养基表面，静置3～5min 后用镊子夹取药敏片放置在培养基上，静置15min后于37℃恒温培养箱倒置培养24h。药敏结果根据美国临床实验室国家标准化委员会(NC-CLS)制定的标准判定。

2 结果与分析

2.1 大肠杆菌菌落形态和镜检结果

将普通营养琼脂平板中分离到的可疑单菌落（凸起、不透明、圆形、扁平、边缘整齐、表面光滑、湿润的白色菌落）（图1），划线接种于伊红美兰培养基、麦康凯培养基上，置37 ℃恒温培养24h。在伊红美兰培养基，可见深紫黑色、光滑、湿润、带有金属光泽的圆形菌落（见图2）。在麦康凯培养基表现为边缘整齐、表面湿润、光滑、桃红色的圆形小菌落（图3）。挑取单个菌落涂片固定进行革兰氏染色，镜检可见两端钝圆、成对或散在存在的红色短小杆菌（图4）。

图1 LB 固体培养基上的菌落

图2 伊红美兰培养基上的菌落

图3 麦康凯培养基上的菌落

图4 大肠杆菌革兰氏染色（×100）

2.2 16S rRNA 测序结果及同源性分析

经过克隆测序比对后发现22 株菌的16S rRNA 基因序列与大肠杆菌的16S rRNA 序列同源性为99%以上（表1）。根据Mat suki 的研究，凡是16S rRNA 序列的同源性大于97%便可认为是同一种，进一步验证了分离纯化到的菌株为大肠杆菌。通过ggtree 软件对22 株大肠杆菌菌株同源性分析，发现从青岛地区分离的菌株与从潍坊地区分离的菌株具有较高的同源性，而从临沂地区分离的菌株与从莱芜地区分离的菌株具有较高的同源性（图5），说明规模化兔场致病性大肠杆菌的同源性具有明显的地区特征。

表1 22 株大肠杆菌扩增基因片段长度及比对结果

图5 22 株大肠杆菌的同源性

2.3 药敏试验结果

由表2 和表3 可知，22 株大肠杆菌中，77.27%菌株对大观霉素较敏感，68.18%菌株对丁胺卡那较为敏感。50%以上的菌株对庆大霉素、链霉素、氟苯尼考、环丙沙星、恩诺沙星、多西环素、氨苄西林具有较强耐药性。由表4 可见，注：菌株QDTE1～QDTE5，来源于青岛地区；菌株WFTE1～WFTE6，来源于潍坊地区；菌株LYTE1～LYTE5，来源于临沂地区；菌株LWTE1～LWTE6，来源于莱芜地区。18.18%菌株耐受8 种药物，22.73%菌株耐受7 种药物，22.73%菌株耐受6 种药物，对5 种以上药物耐药的菌株占比59.09%。因此，本项目分离的肠致病性大肠杆菌为多重耐药性菌株。

表2 22 株大肠杆菌药敏实验结果（抑菌圈直径） 单位：mm

表3 22 株大肠杆菌对10 种抗生素的耐受性

表4 22 株大肠杆菌多重耐药情况

3 讨论

研究表明由于抗生素的滥用和超量使用，使得细菌的耐药性越来越严重，甚至出现了一些超级细菌[6-8]。李重阳等[9]对滨州市地区分离的35 株兔大肠杆菌对27 种常用药物的耐药性情况进行了调查，结果表明，80%菌株产生多重耐药性，仅对头孢曲松和头孢哌酮两种抗生素的敏感性较高。刘照波等[10]从山东潍坊某兔场发生腹泻死亡的病兔，分离了2 株大肠杆菌，药敏试验显示2株大肠杆菌对替米考星、丁胺卡那敏感，对安普霉素、环丙沙星、庆大霉素、强力霉素、氟苯尼考耐药性较为严重。栾慧慧等[11]对山东省茌平、蒙阴、泰安、诸城和莱芜五个地区的7 个规模化兔场分离的的兔肠致病性大肠杆菌进行耐药性分析，结果显示，不同地区兔场所分离的大肠杆菌菌株对常用抗菌药物的耐受程度和耐药种类各不相同，多重耐药菌株占比为79.25%。耐药类型则以3 耐（15.09%）、5 耐（15.09%）和11 耐（11.32%）占比较高，且在2～6 耐和11～12 耐较为集中，多重耐药菌株存在地域差异，以茌平和蒙阴兔场致病菌株的多重耐药现象最为突出，耐药谱型宽，耐药程度严重，诸城兔场分离株谱型较窄，耐药现象轻微。而本试验分离的22 株兔致病性大肠杆菌对常用抗生素耐药情况与上述研究结果稍有不同，但22 株兔大肠杆菌均属于多重耐药菌株。

4 小结

大肠杆菌多重耐药性的产生是兔大肠杆菌病的防控难度增加的主要原因之一，必须引起一线兽医的高度重视。建议大肠杆菌病频发的兔场先通过药敏试验筛选出对本地区大肠杆菌敏感的抗生素，规范的、合理的使用敏感药物针对性的给与治疗，严禁盲目、过量使用抗菌药物。同时还急需高校及科研院所寻求新型的、不易产生耐药性的抗生素替代品，如中药提取物或噬菌体等，加快新型抗菌药物的开发及应用。