CYP4F2和CYP24A1基因多态性与肺结核并糖尿病的相关性

赵琼 ,魏文海 ,李静芸 ,牛慧敏 ,王磊 ,柴国祥 ,韩婕,李兴芳

1甘肃中医药大学,兰州 730030;2 兰州市肺科医院,兰州 730030;3 兰州大学 第一医院,兰州 730030;4 甘肃省中医院,兰州730050

结核病是结核分枝杆菌引起的慢性感染性疾病,可侵袭人体多组织器官。研究[1]显示,肺结核和糖尿病的发生发展及转归关系密切,糖尿病是肺结核发病的高危因素,且患者预后普遍较差。肺结核和糖尿病的发生均离不开遗传因素调控,探究遗传因素在糖尿病并发肺结核发病机制中的相关作用,对糖尿病并发肺结核高危人群的筛查及防控有重要临床意义。单核苷酸多态性(SNPs)因其在人类基因组中的高密度和相对均匀分布而成为首选的遗传标记,并已被广泛应用于精细定位疾病位点和候选基因关联研究[2]。本课题选取 CYP4F2 和CYP24A1基因的单核苷酸多态性(SNP)位点进行分析,探讨CYP4F2和CYP24A1基因多态性与结核病并糖尿病易感性的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取230例肺结核并糖尿病患者作为肺结核并糖尿病(Case)组,其中女性95例、男性135例,吸烟者157例、不吸烟者73例,饮酒者157例、不饮酒者73例。选取同期212例体检健康者作为对照(Control)组,其中女性80 例、男性132 例,吸烟者134例、不吸烟者78例,饮酒者141例、不饮酒者71例。两组研究对象基本临床信息比较,组间年龄、性别、吸烟和饮酒习惯差异均无统计学意义(P＞0.05)。本课题获得甘肃中医药大学医学伦理委员会的批准,研究对象均签署了知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 DNA 提取

采集外周静脉血2 mL,EDTA 抗凝,使用Axy PreP血基因组DNA 小量试剂盒(购自Axygen公司)提取DNA。

1.2.2 基因位点的PCR扩增

选取CYP4F2 基因的rs 2 108 622位点和rs 3 093 106位点,CYP24A1基因的rs 2 762 934位点和rs 2 296 241位点,使用实时荧光定量PCR 反应技术中的Taq Man荧光探针技术,采用ABI公司的Taq Man Universal PCR master Mix试剂盒(内含d NTP、PCR 缓冲液和DNA 聚合酶)、SNP Genoty-Ping Product试剂盒(内含引物、探针)对位点进行基因分型。按照标准96孔板模式在ABI-7 500 fast实时荧光定量PCR 仪上进行定量PCR 反应,实现快速检测。反应体系成分见表1。反应条件:95 ℃10 min的预变性,然后92℃15 s退火、60℃1 min延伸共40个循环。PCR 反应结束后,在ABI 7500 fast仪器上使用SDSv1.63版本的终点分析软件包读取检测结果。

表1 PCR反应体系成分

1.2.3 统计学分析

采用SPSS 22.0软件进行统计学分析,检验各组变量的正态分布情况。正态分布的计量资料表达为x-±s,非正态分布的计量资料采用中位数及四分位间距表示,组间比较采用非参数检验(Kruskal-Wallis H 检验)。计数资料以百分数表示,组间比较采用χ2检验。将所有基因型,用Hardy-Weinberg平衡原理估测样本的群体代表性,采用logistics回归模型计算相对优势比(ORs)及其95%置信区间(confidence intervals CIs)。以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 Hardy-Weinberg遗传平衡检验

为评估样本的群体代表性,采用χ2检验对Case组和Control组4个SNP位点的基因分型结果进行分析。Case组和Control组的位点Hardy-Weinberg平衡检验P＞0.05,提示纳入的样本来自可随机婚配的稳定群体,具有群体代表性。见表2。

表2 Hardy-Weinberg遗传平衡检验

2.3 基因型分布比较

计算Case组和Control组不同位点的基因型频率并进行组间比较,CYP4F2 rs 2 108 622和rs 3 093 106位点,CYP24A1 rs 2 296 241位点的基因型频率在Case组和Control组中无统计学差异(P＞0.05);CYP24A1 rs 2 762 934位点AG 基因型频率Case组高于Control组,GG 和AA 基因型频率Case组低于Control组,组间差异具有统计学意义(P＜0.01)。见表3。

表3 Case组和Control组基因型分布比较

2.4 各SNP位点等位基因频率比较

对4个SNP位点分别统计计算等位基因频率并进行组间比较:CYP4F2 rs 2 108 622 和rs 3 093 106位点,CYP24A1 rs 2 296 241位点的基因型频率分布在Case组和Control组中差异无统计学意义(P＞0.05);CYP24A1 rs 2 762 934位点的A等位基因的频率Case组高于Control组,差异具有统计学意义(P＜0.05)。见表4。

表4 Case组和Control组各SNP位点等位基因频率比较

2.5 不同遗传模型下rs 2 762 934位点基因型的比较

对于上述基因型趋势分析中P＜0.05 的rs 2 762 934位点作进一步分析,rs 2 762 934位点的等位基因为A/G 二态型,野生型均为A。由于未知基因型与表达方式的关系,从以下遗传模型分别进行分析:共显性模型AG vs GG,AA vs GG;显性模型GG vs AG-AA;隐性模型GG-AG vs AA;超显性模型GG-AA vs AG。rs 2 762 934位点基因型共显性模型(AG vs GG,AA vs GG)具有统计学意义,基因型AG较基因型GG发生Case的OR值为1.90(P=0.003,95%CI=1.28～2.81),基因型AA 较基因型GG 发生Case的OR 值为0.58(P=0.003,95%CI=0.14～2.38)。显性模型(AG-AA vs GG)的OR值为1.79(P=0.003,95%CI=1.22～2.63),具有统计学差异。隐性模型(AA vs G G-AG)的OR 值为0.45(P=0.25,95%CI=0.11～1.84),无统计学差异。超显性模型(AG vs GG-AA)的OR值为1.93(P=0.001,95%CI=1.31～2.86),具有统计学差异。见表5。

表5 rs2762934位点基因型在不同遗传模型下的比较

3 讨论

CYP4F2和CYP24A1是CYP450家族成员之一。CYP4F2是人体代谢花生四烯酸(AA)生成具有调节肾功能和血管张力的20-HETE 最主要的代谢酶。20-HETE水平升高与血管氧化应激、内皮功能障碍和高输精管外周阻力有关,参与血压、肾功能、脑血流、肺循环等多种血管事件的调节[3]。CYP4F2被认为是是糖尿病和高血压及心脑血管疾病的重要候选基因。由CYP24A1 基因编码的25(OH)D3-24-羟化酶是维生素D 代谢关键酶,维生素D 本身没有生物活性,进入血液循环后在肝脏中转化为25(OH)D3,并在肾脏中进一步转化为具有生物活性的1,25(OH)2D3。25(OH)D3-24-羟化酶催化25(OH)D3和1,25(OH)2D3降解为24-羟基化产物,导致维生素D 失活。近年来,越来越多的研究[4-5]表明,维生素D 缺乏会增加糖尿病的发病风险。人们在全基因组关联研究(GWAS)中发现了许多可影响血清维生素D 浓度的基因多态性位点,其中包括维生素D 代谢基因CYP24A1[6]。目前已有研究[7]表明,CYP24A1基因多态性与糖尿病关系密切。CYP24A1 rs 2 296 241携带A 等位基因是移植术后糖尿病的危险因素。CYP24A1基因rs 2 248 359、rs 6 068 816位点和2型糖尿病具有显著的关联性[8]。CYP24A1 rs 4 809 957等位基因G在2型糖尿病家族中的传递失衡,并导致维生素D缺乏[9]。但目前尚无CYP4F2基因rs 2 108 622和rs 3 093 106位点,CYP24A1基因的rs 2 762 934位点和rs 2 296 241位点与肺结核并糖尿病相关性的研究报道。

为了解CYP4F2和CYP24A1基因多态性与肺结核并糖尿病的相关性,本研究选取肺结核并糖尿病患者230例和体检健康者212例作为研究对象,对CYP4F2 rs 2 108 622 和rs 3 093 106位点,CYP24A1基因的rs 2 762 934位点和rs 2 296 241位点进行分析,所检测得到的SNP基因频率均达到Har-dy-Weinberg遗传平衡(P＞0.05),提示纳入的样本来自可随机婚配的稳定群体,具有群体代表性。

本研究结果显示,CYP4F2 rs 2 108 622和rs 3 093 106位点、CYP24A1 rs 2 296 241位点的基因型和等位基因频率在Case组和Control组中无均统计学差异,提示上述位点与肺结核并糖尿病不相关。CYP24A1 rs 2 762 934位点AG 基因型频率Case组高于Control组,GG 和AA 基因型频率Case组低于Control组,组间差异具有统计学意义,提示基因型杂合子个体较纯合子个体发生Case的风险增加。rs 2 762 934位点A 等位基因的频率Case组高于Control组,差异具有统计学意义(P＜0.05),提示A 等位基因是Case的风险基因。在显性模型条件下(AG-AA vs GG),携带A 等位基因的个体较未携带A 等位基因的个体发生Case的风险増加1.79倍。超显性模型条件下(GG-AA vs AG)下,基因型纯合子个体较杂合子个体发生Case的风险増加1.93倍,具有统计学差异。而在隐性模型(GG-AG vs AA)条件下,Case组和Control组的基因型频率差异没有统计学意义。上述不同遗传模型的分析进一步表明:rs 2 762 934位点基因型杂合子个体较纯合子个体发生Case的风险增加,A 等位基因是Case的风险基因。

综上所述,CYP4F2 rs 2 108 622 和 rs 3 093 106位点,CYP24A1 rs 2 296 241位点与肺结核并糖尿病均不相关。CYP24A1位点多态性与肺结核并糖尿病相关,基因型杂合子个体比纯合子个体发生肺结核并糖尿病的风险高,A 等位基因可能增加患病风险。